金葡菌肠毒素C2的单克隆抗体制备、鉴定

【摘要】 目的：制备抗金葡菌肠毒素c2(sec2)的单克隆抗体（mcab）,并建立sec2检测方法。方法：以金葡菌培养液中纯化的sec2为抗原，免疫balb/c小鼠，制备单克隆抗体；并对单克隆抗体的特性进行鉴定；利用纯化后的抗体建立了夹心elisa定量检测sec2方法，并进行了验证和初步应用。结果：筛选出4株稳定分泌抗sec2抗体的杂交瘤细胞株，其免疫球蛋白亚类均为igg1，除两株单抗的sec2识别位点相同外，其余单抗均特异性识别sec2的不同结合位点。建立的夹心elisa定量检测法，特异性、灵敏度、重复性均较好，检测sec2范围为0.5～20 ng/ml，回收率在97.8%～101%，变异系数为2%～5%。结论：本研究制备的抗sec2的单克隆抗体，可用于建立了sec2定量检测方法，为控制金葡素制品质量和金葡菌肠毒素研究提供了较实用的方法。

【关键词】 金葡菌肠毒素c2 单克隆抗体 夹心elisa

　　preparation and preliminary application of monoclonal antibody against staphylococcal enterotoxin c2

　　luo peng, l huixian, zhang shumin.

　　national institute of control phamaceutical and biological products, bejing 100050, china

　　［abstract］ objective:to obtain monoclonal antibodies(mcab) against staphylococcal enterotoxin c2(sec2) and establish method for detecting s:the secreted sec2 from staphylococcus aureus was used as antigen to immune balb/c mice. monoclonal antibodies against sec2 were prepared by normal hybridoma technique. by identifying the characters of mcabs, the quantitative detection elisa test method were established and were preliminarily s:four hybridmas producing antibodies against sec2 were obtained. igg isotypes of four mcabs were igg1. their binding site was different except two mcabs that shared the same binding mcabs were proved to be specific for sandwich elisa method had good specificity, sensitivity and reproducibility, and it was founded to be able to detect sec2 at concentration from 0.5 to 20 ng/ml. its recovery ranged between 97.8% and 101%,and cv value ranged between 2% and 5%.conclusion:the prepared mcab against sec2 can be used for sec2 immunoassay. this work provides a basis for controlling the quality of jinpusu and researching staphylococcal enterotoxin.

　　［key words］ staphylococcal enterotoxin c2；monoclonal antibody；sandwich elisa

　　金葡菌肠毒素（staphyloccocal enterotoxin）是金黄色葡萄球菌分泌的外毒素，为水溶性单肽链毒性蛋白质，主要分为肠毒素a、b、c、d、e，其中肠毒素c又可分为c1、c2、c3三个亚型。1989年瑞典人white等［1］首次提出超抗原(superantigen)的概念，指出金葡菌肠毒素是最典型的超抗原，可不需要抗原递呈细胞(apc)处理，以完整的蛋白质分子形式直接与apc膜上的mhcⅱ类分子抗原结合槽外侧特异结合，导致带有特异性vβ节段的t细胞大量活化增殖。其活化的t细胞数是普通抗原数千倍乃至数万倍，可产生强大免疫效应。

　　金葡素注射液用于肿瘤病人放化疗后的辅助治疗，具有升高白细胞的作用，由于来源于临床实践，其前期科研并不深入，有效成分不很清楚［2］。超抗原理论提示我们金葡素的免疫调节作用可能来自于肠毒素。经我们与厂家合作，在培养产物中提取到微量肠毒素，经氨基酸序列测定和比较确定是肠毒素c2亚型（staphyloccocal enterotoxin c2, sec2），通过药效学实验证实了sec2是金葡素有效成分。为更好控制产品质量，开展定量检测，我们运用单克隆抗体技术建立了sec2的双抗夹心elisa检测法。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 金葡菌肠毒素c2(sec2)和金葡素注射液样品由沈阳协合集团提供，金葡菌肠毒素sea、seb、sec1军科院微生物所赠，sed购自toxin technology，sp2/0骨髓瘤细胞由本所细胞室保存，rpmi1640、hat和ht培养基均为gibco产品，胎牛血清为hyclone产品，新生牛血清为杭州四季青生物制品研究所产品。peg 4000购自fluka，抗体亚类测定试剂盒为pierce公司产品，辣根过氧化物酶（hrp）为sigma公司产品，hrp标记的羊抗鼠抗体购自天象邦定公司，清洁级balb/c小鼠由本所动物繁育中心提供，多抗法肠毒素c检测试剂盒由沈阳协合集团提供、上海医学院微生物教研室研制，酶标板购自greiner公司，酶标仪μquant购自biotek公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 杂交瘤细胞的建立 以纯化sec2免疫balb/c小鼠，取小鼠脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞采用50%peg 4000融合，用间接elisa法筛选阳性克隆并鉴定抗体分泌水平，经有限稀释法3次克隆化，取生长良好，分泌稳定的杂交瘤细胞建株，扩大培养后入液氮保存。

　　1.2.2 单克隆抗体的制备与提取 以2×106杂交瘤细胞/只接种小鼠，诱生腹水。参考文献［3］采用辛酸硫酸铵沉淀法提取单抗，sdapage电泳测分子量和纯度，lowrry法测定蛋白浓度，过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶。

　　1.2.3 单克隆抗体性质的鉴定 取杂交瘤细胞培养上清，用抗体亚类测定试剂盒检测单抗的型别；竞争结合法进行单抗的结合位点分析，包被抗原2 μg/ml，先加入未标记抗体结合，再加入不同的hrp标记的抗体结合，设阳性（相同抗体）和阴性（无关抗体）对照，37℃、1小时后显色测od值，计算阻断抑制率；相对亲和力测定，从相同最高浓度2 mg/ml的单抗系列稀释的分别与固定浓度5 μg/ml的包被抗原反应，加hrp标记的羊抗鼠抗体显色，当显色反应达到平台期时单抗的浓度越低则该抗体的相对亲和力越大；酶标抗体效价测定，从1∶1 000开始系列稀释酶标单抗与固定浓度的抗原反应，以测定仍为阳性的最高稀释倍数作为酶标抗体的效价；单抗特异性检测，取肠毒素 sea、seb、sec1、sec2和sed 15 μg/ml，4倍系列稀释包被，再分别加1∶800浓度的酶标单抗，显色后判定有无交叉反应。

　　1.2.4 elisa夹心法的条件选择与方法验证 选择不同结合位点的单抗配对，用矩阵法确定最佳的包被浓度和酶标抗体浓度，再确定可检测抗原的含量范围 ，绘制标准曲线；取10 ng/ml肠毒素sea、seb、sec1、sec2和sed用elisa夹心法判断方法的特异性, 当od值>2倍阴性对照（pbs）判为阳性；检测灵敏度, 将参考品作系列稀释，判断最低检出量，即od值>2倍阴性对照（pbs）且od值>阴性对照的3sd；分3次检测同批1007s金葡素样品，比较结果重复性即变异系数；精密度（回收率）测定，取1007s分别与等体积参考品混合制成新样品，3次检测其sec2含量，计算回收率和可靠性（变异系数）。

　　1.2.5 与多抗法elisa检测试剂盒比较 上海医学院sec2检测试剂盒的抗体是来自羊免疫血清提取的igg，用本研究方法与多抗检测方法同时对40批沈阳协合的金葡素注射液样品进行检测，比较两方法结果差异。初步确定金葡素注射液中sec2含量范围。

　　2 结果

　　2.1 杂交瘤细胞的建立与单抗制备提取 共挑选出4株高滴度杂交瘤细胞。命名为3b7、4f7、4d7和4f6，用它们制备的单抗分别命名为a、b、c和d。经提取后，非还原sdspage分析单抗纯度达80%以上，分子量约为150 000～160 000。

　　2.2 单克隆抗体性质的鉴定 4株单抗均为igg1亚类的免疫球蛋白，提取后的蛋白含量分别为a 13 mg/ml、b 5.9 mg/ml、c 8.9 mg/ml和d 11 mg/ml。4株单抗中只有b和c的结合位点是针对同一抗原决定簇，阻断抑制率>90%, 其它单抗间结合位点分别针对不同抗原决定簇，阻断抑制率<30%（表1）。相对亲和力测定显示d>a>b>c。酶标抗体效价a：1∶1 000，b：1∶600，c：1∶800，d：1∶2 000。特异性检测表明，基本上4株单抗仅与特异性抗原sec2反应，而与其它相似的金葡菌肠毒素无明显交叉反应，但单抗a在sec1抗原高浓度时(>1 μg/ml)与sec1有微弱交叉反应（od值0.1～0.2）。

　　2.3 elisa夹心法的条件选择与方法验证 根据比较选择，确定包被抗体为c，包被浓度为5 μg/ml，酶标抗体为a，使用浓度为1∶500。检出范围为0.5～20 ng/ml，绘制标准曲线见图1，r=0.998。elisa夹心法特异性好，与其它型肠毒素无交叉反应；最低检出量为0.5 ng/ml，精密度高，样品回收率为97.8%～101%；重复性好，变异系数cv在2.2%～5.2%之间，见表2和表3。

　　表1 4株单抗间的阻断抑制率（略）

　　tab.1 percentage of the inhibition of antibodiy competitive elisa between mcabs

　　图1 夹心elisa法测定sec2的标准曲线（略）

　　fig.1 sandwich elisa standard curve for sec2

　表2 双抗夹心elisa法的重复性（略）

　　tab.2 reproducibility and sensitivity of twomcabsandwich elisa

　　表3 双抗夹心elisa法的精密度和可靠性（略）

　　tab.3 precision and reliability of twomcabsandwich elisa

　　图2 多抗与单抗elisa法检测sec2的结果比较（略）

　　fig.2 comparison the result of elisa with polyclonal and monoclonal antibodies

　　2.4 与多抗法elisa 检测盒比较 由两点对应趋势图可见，单抗法与多抗法所测结果的平行性好，多抗法平均结果稍高于单抗法(高3.65%) ，两者进行差数t检验，没有显著差异。40批样品sec2的含量范围在8～16 ng/ml之间，见图2。

　　3 讨论

　　常见的金葡菌肠毒素主要为sea和seb，它们也是目前广泛应用于抗肿瘤生物治疗研究的超抗原。肠毒素c特别是sec2较少见，较之sea和seb，sec2的毒性较小。检索文献，国内尚未发现制备针对sec2单克隆抗体的报道。

　　金葡素注射液的传统检测方法中凝固酶指标不具代表意义，而升白细胞试验的造模难控制、动物差异大均给试验质控带来困难［4］。为此，在明确有效成分为sec2的基础上，作者采用生产菌种分泌的肠毒素sec2，免疫balb/c小鼠，获得了4株抗sec2的单克隆抗体，鉴定结果表明，4株单抗均为igg1亚类，结合位点除b和c相同外，其余均不同，特异性检测中单抗a与高浓度sec1有微弱交叉反应，可能是由于sec1和sec2同属c型肠毒素，两者氨基酸组成和空间构型十分相似，同源性高达95%以上造成，但在本方法检测的肠毒素含量范围内不会出现非特异反应［5］。与已有的sec2多抗法检测试剂盒比较，检测结果符合率高，单抗法的结果略低，我们认为是其特异性高的体现。我们建立的单抗夹心elisa定量检测法，特异性好，灵敏度高，简便易行。通过对大量送检样品的检测，为确定金葡素制品sec2含量的质量标准提供了依据。目前我们研制的抗sec2单克隆抗体及应用已申请专利，金葡素注射液肠毒素含量测定的方法已被《中国药典》三部（2005版）收录。

　　抗sec2单克隆抗体的成功制备及elisa夹心定量检测法建立，不仅能更好控制金葡素产品质量，而且为食品卫生检测及研究肠毒素作为超抗原的免疫学应用等提供了有利手段。

【参考文献】
　　1 white j，herman a, pullen a m et al. the vbetaspecific superantigen staphylococcal enterotoxin b:stimulation of mature t cells and clonal deletion in neonatal mice ［j］. cell, 1989; 56(1):2735.

　　2 朱正中. 高聚金葡素在肿瘤治疗中的作用 ［j］.肿瘤防治研究, 1995；6（22）：335338.

　　3 朱立平, 陈学清. 免疫学常用实验方法 ［m］ .北京：人民军医出版社，2000:5174.

　　4 中国生物制品标准化委员会.中国生物制品规程2000年版暂行规程 ［m］ . 北京：化学工业出版社，2000:1620.

　　5 hovda c j，hackett s p, bohach g a. nucleuotide sequence of the staphylococcal enterotoxin c3 gene: sequence comparison of all three type c staphylococcal enterotoxins ［j］. mol gen genet, 1990; 220:329333.