木犀草素对粪肠球菌毒力因子作用机制的研究

　　牙髓病和根尖周病常由细菌感染引发，目前临 床上常采用根管治疗术对其进行治疗。我国根管治 疗的技术虽然已经很成熟了，但临床上结合各种因素仍存在一定的失败率。近年来很多学者认为根管内微生物的感染是造成根管治疗失败的主要原 因[1—2]。有报道表明，在根管治疗失败的病例中，粪 肠球菌的检出率较高，说明粪肠球菌是较常见的细 菌[3]。粪肠球菌常常继发于根管内而感染，是主要 致病菌，它的生存能力极强。粪肠球菌的生存力较 顽固，其生物被膜的存活力和致病性更加顽强，传 统的根管治疗术对形成生物被膜的根管的治愈率不 高。因此对于微生物的感染造成治疗失败的研究受 到广大研究者的关注。加之现在临床上使用的消毒 药物对感染粪肠球菌的根管的消毒效果不佳，甚至 有些消毒药物还具有一定的毒副作用，导致粪肠球 菌产生耐药性，所以越来越多的研究者转向来研究 毒副作用小并且不容易形成抗药性的中药。本研究 的意义在于更进一步的了解木犀草素对生物被膜状 态下的粪肠球菌的抑制效果并探讨其对粪肠球菌毒 力因子gelE、esp、ebpA的影响的机制。

　　1 材料与方法

    1.1主要材料和仪器粪肠球菌标准株ATCC (广 东环凯生物科技有限公司），木犀草素标准品（上海 金穗生物科技有限公司，产品批号20150301， HPLC>98%)，脑心浸液琼脂培养基、脑心浸液肉 汤（杭州天和微生物试剂有限公司），噻唑兰、 MTT (上海金穗生物科技有限公司），二甲基亚砜 (天津致远化工有限公司），引物（上海生工生物工 程有限公司），Biometra PCR 仪（BIOME-TRA， 德国），SMARTSPECTMPLUS超微量分光光度计 (美国），琼脂糖（西班牙），PBS缓冲液（博士德 生物）。

　　1.2 方法

    1.2 1菌悬液的制备首先取粪肠球菌标准株接种 于装有BHI液体培养基的试管中37 °C摇床厌氧复 苏24 h。将复苏后的粪肠球菌划线接种于BHI琼脂 培养基中，放置在37 C恒温培养箱里厌氧培养 24 h。挑取24 h后固体培养基上的单个菌落放置于 装有BHI液体培养基的试管中，37 C摇床里培养 24 h;最后利用麦氏比浊法配制菌悬液并使其浓度 达到 0. 5 McFarland (1X108 个细胞/mL)。

　　1. 2 2药液的制备取木犀草素标准品用二甲基亚 砜溶解使其浓度达到16 mg/mL，过滤后，利用对倍 稀释法将木犀草素稀释成8、4、2、1和0. 5 mg/mL 的浓度，备用。

　　1. 2 3木犀草素对粪肠球菌生物被膜的抑菌性的研 究用灭菌后96孔板，向每孔中放50 pL的粪肠球 菌菌悬液和150 pL的BHI液体培养基，封口膜密 封，37 C条件下厌氧培养24 h (激光共聚焦）观 察，待成功建立粪肠球菌生物被膜模型，严格贴壁 去除原液体，同时随机分7组包括5个实验组、 1个阴性对照组、1个空白对照组；分别向实验组中 加入100 PL的浓度为8、4、2、1和0. 5 mg/mL的 木犀草素药液，阴性对照组含有液体培养基和菌悬 液，空白对照组只含有BHI液体培养基；将96孔 板放于培养箱中37 C条件下厌氧培养12 h。12 h 后无菌PBS冲洗2〜3次去除药液。每孔中加入20 PL MTT药液（浓度为5 mg/mL)，37 C避光培 养4h。每孔放100 PL的二甲基亚砜溶液，摇床震荡 15 min；待结晶体消失后，全自动酶标仪分别检测490 nm的吸光度（A值）。如下公式计算：抑菌率= (阴性对照组A值一实验组A值）/ (阴性对照组A值一空白对照组A值）X100%。

　　1. 2 4 CLSM观察不同浓度木犀草素对粪肠球菌 生物被膜的影响将经高压灭菌后的20 mm X 20 mm的盖玻片放在6孔板中，分别在盖玻片表面 滴加300 PL的粪肠球菌菌悬液，再沿6孔板的侧壁 向其中小心加入3 mL的BHI液体培养基，封口膜 封口，37 C恒温培养箱厌氧条件下培养24 h。经共 聚焦检测确定生物被膜模型建立成功后，去除原培 养液同时将其随机分为6组（5个实验组和1个阴 性对照组），分别向5个实验组中加入浓度为8、4、 5、1、0. 5 mg/mL的木犀草素药液，阴性对照组中 不加药液，封口膜封口，继续厌氧培养12 h。12 h 后去除液体。PBS小心冲洗2〜3次去除表面浮游的 细菌；然后滴加2.5%的戊二醛固定10 min，再次 用PBS缓冲液小心冲洗2〜3次后，分别在生物被 膜表面滴加150 pL染色剂（AO、EB等份混合后0 = 20稀释成工作液），暗室室温孵育15 min后，用 CLSM观察生物被膜中死菌与活菌的密度及其比例 (镜下活菌呈绿色，死菌呈红色）。

　　1. 2 5木犀草素对粪肠球菌的毒力因子影响的研究0. 2 5. 1分组处理和PCR扩增选取适应浓度的木 犀草素（8、4、2和0 mg/mL)，分别加入到配制好的 粪肠球菌菌悬液中。置于37 C厌氧条件下培养24h 后，分别取1 mL样本按Total RNA提取试剂盒 (RNAISO TM Plus)要求提取其总RNA；并用RNA PCR KIT (AMV) VER 3 0试剂盒反转录合成cDNA。 同时用由上海生工生物合成设计的3对引物（见表1)， 按PCR反应试剂盒说明，通过PCR仪，对粪肠球菌毒 力因子gelE、ebpA、esp进行PCR扩增。扩增后的 PCR产物，置一20 C冷冻冰箱，备用。0. 2 5. 2琼脂糖凝胶电泳及其分析取0. 6g的琼脂糖粉末与40 mL1XTAE电泳缓冲液混合,加热 至全部溶解后,再向其中加入0. 4 PL的EB,混合 后，沿侧壁缓慢使液体流入胶板中，冷却制成凝胶。 将样本（8 pL PCR扩增产物+ 2 pL的6XLoading buffer混合液)滴加入凝胶小孔中，于120 V, 30 min 条 件 下 进 行 电 泳 。 电 泳 30 min 后 ， 取 下 凝 胶 置于UVI成像仪上。观察结果并进行拍照，最后利 用软件进行分析。

　　1.3统计学分析所有数据均采用SPSS 17. 0统计 软件进行整理和统计。计量资料采用均数士标准差 (王±0表示。两组间计量资料的比较采用z检验。 P<0. 05为差异有统计学意义。

　　2 结果

   2 1不同浓度木犀草素对粪肠球菌生物被膜的抑制 率不同浓度的木犀草素作用于粪肠球菌生物被膜 24 h后，运用MTT法测各组的A值并计算木犀草 素的抑囷率；最后的结果显示：在0. 5〜8 mg/mL 的浓度区间随着药物浓度的增加其抑菌能力也增强。 木犀草素的浓度为0. 5 mg/mL时其抑菌率为 40. 02%。当达到8 mg/mL时抑菌率为90. 55%。 并且各组的抑菌率分别与阴性对照组相比差异均有 统计学意义（P〈0. 05)(见表2)。

　　表2不同浓度木犀草素对粪肠球菌生物被膜的抑制率 随着药物浓度依次增加各条带的亮度逐渐变暗。（2) 当药物浓度达到8 mg/mL时各毒力因子的条带基本 消失。（3)各组别与阴性对照组两两比较，差异有 统计学意义（P〈0. 05)，见表3。说明木犀草素不 同程度的抑制了粪肠球菌毒力因子gelE、esp、 ebpA的表达；并且随着药物浓度的增加其抑制效果 逐渐增加。

　　2 2木犀草素对粪肠球菌生物被膜的影响不同浓 度的木犀草素作用于粪肠球菌生物被膜， 通 过 AO 和EB染色后，CLSM镜下观察活菌和死菌的密度 及其比例。在0. 5〜8 mg/mL浓度区间内CLSM观 察到死菌的数量逐渐增加。说明木犀草素对粪肠球 菌生物被膜的生长活性有抑制作用（见图1)。

　　2  3不同浓度的木犀草素对粪肠球菌的毒力因子 gelE、esp、ebpA基因表达水平的影响最后的 PCR扩增产物进行电泳后的结果显示：（1)阴性对 照 组 时 毒 力 因 子 gelE、 esp、 ebpA 的 电 泳 条 带 最 亮，药物浓度为2mg/mL时其条带的亮度次之，但3讨论木犀草素是中药夏枯草(LuteoUn)的主要有 效成分之一。木犀草素属于黄酮类化合物，具有抗 菌、抗炎、保护心血管、解痉、祛痰、抑制酶活性、 免疫调节、抗氧化、抗辐射、利尿、利胆、抗肿瘤等等多种特性[4]。有研究报道夏枯草对肠道致病菌 和条件致病菌具有较强的抑制作用，但对于木犀草 素对粪肠球菌的作用尚没有研究，故本实验选取夏枯 草中的木犀草素成分作为研究对象，探讨其对粪肠球 菌的作用 。 实验最后的结果显示： 在0 5〜8 mg/mL，木犀草素对粪肠球菌生物被膜能起到抑制效果，并且 随着药物浓度的逐渐增加其抑菌效果也逐渐明显，当 浓度达8 mg/mL时，其抑菌效果最明显。

　　3.讨论

    粪肠球菌在根管再治疗患者的根管中检出率高 且数量多，极易形成生物被膜，产生抗药性，使治 疗难度加大[6]。有研究报道：粪肠球菌极易在根管 内形成生物被膜可能与其毒力因子明胶酶（gelE)、 表面蛋白（Esp)和菌毛操纵子（ebpA)等有关系。 gelE：是细胞外锌金属蛋白酶的一种，可以酶解宿 主细胞壁和细胞间质的胶原蛋白[7]，它的长度大概 为1 530个碱基，位于粪肠球菌染色体上。粪肠球 菌调节因子基因fe•和3个启动子位于其上游，能 够影响明胶酶的表达水平。下游主要与其一起参与 宿主的组织损伤，是丝氨酸蛋白基因SprE。明胶酶 对组织的形成和重塑是通过胞外的降解作用来调节 的。经研究发现去除giE基因后，粪肠球菌形成生 物被膜的能力下降[8]。ebpA: ebp基因座主要影响 菌毛形成，而生物被膜形成的必要条件就是菌毛的 形成。bpA是粪肠球菌菌毛操纵子，常常发现于粪 肠球菌分离株中，影响着生物被膜和菌毛的形成[]。 有研究发现：与野生株比较，bpA表达水平和菌毛 蛋白生成量减少，生物被膜形成量也会跟着下 降[1°]。

    Esp：由1 873个氨基酸组成的与细胞壁相 关的蛋白，在粪肠球菌中它的表面分子质量最大， 由5 622个碱基对构成e#基因。e#基因的菌株可 诱发多重感染，esp基因普遍具有形成生物被膜的 能力，可使细菌的感染更加持久，呈慢性长期的趋 势，因此提高了感染能力[11]为了说明木犀草素对粪肠球菌的抑菌作用是否 通过其相关毒力因子而完成。本实验选择与粪肠球 菌生物被膜相关联的3种毒力因子gelE、esp、 ebpA为研究对象，观察不同浓度作用后的变化。

    结果显示:（1)木犀草素的浓度在 0. 5 〜8 mg/mL 时， 对粪肠球菌的3种毒力因子gelE、esp、ebpA的 mRNA的表达均有不同程度的干扰或抑制作用。即 随着浓度的增加，其对3种毒力因子表达的抑制作 用越来越强。当浓度达到8 mg/mL时可完全抑制 gelE、 esp、 ebpA 3种毒力因子mRNA的转录表达 水平。（2)实验结果提示：木犀草素对粪肠球菌生 物被膜及相关毒力因子均有明显的抑制作用。这一 研究发现显示木犀草素的应用前景广阔。（3)大量 文献显示木犀草素具有抗炎、抗金黄色葡萄球菌等 作用，但是目前尚没有研究发现木犀草素对粪肠球 菌及其毒力因子的抑制作用，而本实验对这一空缺 进行了实验研究，对木犀草素的临床应用提供理论 基础。