大肠杆菌热稳定肠毒素的检测分析

摘　要：目的：探讨大肠杆菌热稳定肠毒素的检测方法与效果。方法：采用三种方法检测大肠杆菌的热稳定肠毒素。结果：酶联免疫吸附实验与双向琼脂扩散实验的LT检出率与实验灵敏度比乳鼠罐胃实验要高，而且酶联免疫吸附实验能同时测定十几个样品。结论：三种方法检测大肠杆菌热稳定性肠毒素，其中酶联免疫吸附实验方法特异性强、重复性好；双向琼脂扩散实验是测定LT的经典方法，敏感性较高；乳鼠实验被认为是测定ST 的常规方法，但其检出不高且受很多因素制约。

关键词：LT肠毒素；大肠杆菌；免疫佐剂；疫苗
　　不耐热肠毒素（Heat-labile enterotoxin，LT）是产肠毒素性大肠杆菌（Enterotoxigenic ，ETEC）产生的一种对热敏感的毒素，是引起旅游者腹泻、婴幼儿严重性甚至致命性腹泻和某些家畜腹泻的主要原因之一[1]。LT有LT-I和LT-Ⅱ两型，前者由ETEC遗传因子大质粒编码产生，后者由染色体DNA编码产生。LT是由1个分子量约28 kD的A亚基（IJTA）和5个分子量约为12 kD的B亚基（LTB）构成的六聚体（Mr 90 kD）。LTA具有ADP-核糖基转移酶活性，可使胞内cAMP水平升高，细胞液体及电解质流失，进而导致腹泻。五聚体的B亚单位包含有细胞表面神经节甘脂（GM1）结合位点，通过LTB与GM1的结合，LT得以进入胞内并进而发挥毒性。LT具有良好的免疫原性，LT含有引起LT-特异性抗体应答的大部分优势抗原表位，两者均能有效地启动机体产生局部和全身的T细胞和B细胞免疫应答，还能使T、B细胞产生长期的记忆反应。已经证明，不同地区分离的ETEC致病菌株产生的LT之间的免疫原性完全相同，并与霍乱弧菌肠毒素有一定抗原关系。人源和动物来源的ETEC的LT基因也有很多同源性[2]。因此，选择一种快速、灵敏、合适的方法检测大肠杆菌的LT具有重要的生物学意义。目前测定LT的方法很多，如酶联免疫吸附实验、乳兔口服实验、兔皮肤蓝斑试、双向琼脂扩散实验、乳鼠罐胃实验，大白鼠空肠灌注法、被动免疫溶血抑制实验、固相放射免疫法等。为探索测定大肠杆菌IT的简便方法，提高测定的效率，笔者主要采用酶联免疫吸附实验、双向琼脂扩散实验、乳鼠罐胃实验三种具有代表性的方法，对猪源大肠杆菌的不同菌株做了热敏感肠毒素的检测实验。
1 资料与方法
1.1  一般资料：菌株：LT标准阳性菌株由微生物室分离鉴定并保存，血清型有O8，O11，O20，O39等。食品来源：健康成年猪肉购自某市集贸市场。培养基：改良明卡培养基，Elek氏培养基，自制。仪器：DSHZ-300型多用途水浴恒温振荡器、高速冷冻离心机（型号TGL-16G）、HZQ XlOO型振荡培养箱、WZ-2A型磁力搅拌器。
1.2  方法
1.2.1 产毒培养：将实验菌株和阳性及阴性对照菌株分别接种于0.6 ml改良明卡汤培养基内，37℃振荡培养过夜。加入20 000 IU/ml的多粘菌素B 0.05 ml，于37℃，1 h，离心4 000 r/min，15 min，分离上清液，加入0.1%硫柳汞0.05 ml，镜检无菌后。于4℃保存待用。
1.2.2 酶联免疫吸附实验检测LT：先在产肠毒素大肠杆菌LT和ST酶标诊断试剂盒中取出包被用LT抗体管，加入包被液0.5 ml，混匀后全部吸出于3.6 ml包被液中混匀，以每孔100 μl量加入到40孔聚苯乙烯硬反应板中，第1孔留空作对照，于4℃冰箱湿盒中过夜。将板中溶液甩去，用洗涤液I洗3次，甩尽液体，翻转反应板，在吸水纸上拍打，去尽孔中残留液体。每孔加100 μl封闭液，于37℃水浴中1 h。用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。每孔分别加各冲实验菌株产毒培养液100 μl，37℃水浴中1 h。用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。先在酶标LT抗体管中加0.5 ml稀释液，混匀后全部吸出于3.6 ml稀释液中混匀，每孔加100 μl，37℃水浴中1 h。用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。每孔（包括第1孔）各加基质液100 μl，室温下避光作用5～10 min，加入终止液50 μl。以酶标仪在波长492 nm下测定吸光度OD值，待测标本OD值大于阴性对照3倍以上为阳性，目测颜色为桔黄色或明显高于阴性对照为阳性。
1.2.3 双向琼脂扩散实验检测LT：将被检菌株按五点环形接种于Elek氏培养基上。以同样操作，共做两份，于36℃培养48 h。在每株菌的菌苔上放多粘菌素B纸片，于36℃经5～6 h，使肠毒素渗入琼脂中，在五点环形菌苔各5 mm处的中央，挖1个直径4 mm的圆孔，并用1滴琼脂垫底。在平板的中央孔内滴加LT抗毒素30 μl，用已知产LT和不产毒菌株作对照，于36℃经15～20 h观察结果。在菌斑和抗毒素孔之间出现白色沉淀带者为阳性，无沉淀带者为阴性。
1.2.4 乳鼠罐胃实验检测LT：将被检菌株接种于Honda氏产毒肉汤内，于36℃培养24 h，以3 000 r/min离心30 min，取上清液经薄膜滤器过滤，加热60℃ 30 min，每毫升滤液内加入2%伊文思蓝溶液0.02 ml。将此滤液用塑料小管注入1～4日龄的乳鼠胃内0.1 ml，同时接种3～4只，禁食3～4 h后用三氯甲烷麻醉，取出全部肠管，称量肠管（包括积液）重量及剩余体重。肠管重量与剩余体重之比大于0.09为阳性，0.07～0.09为可疑。
2 结果
2.1  LT的测定情况：对实验菌株分别采用酶联免疫吸附实验、双向琼脂扩散实验、乳鼠罐胃实验三种方法测定LT，结果见表1。从表中可以看出：酶联免疫吸附实验与双向琼脂扩散实验的LT检出率比乳鼠罐胃实验要高，而且酶联免疫吸附实验能同时测定十几个样品。
表1  三种实验方法对实验菌株LT的测定

菌株        阳性对照      1   2    3    4    5    6    7      8    9    10

酶联免疫吸附  #           ++  #    #    #    #    #     #     #    +   #

双向琼脂扩散  #           +   +    +    #    #    ++   ++    ++   ++  ++

乳鼠罐胃      #           +   #    +    +    +    #     -     -     +   -

2.2  灵敏度比较：酶联免疫吸附实验和双向琼脂扩散实验的灵敏度比较。以乳鼠罐胃实验测定结果为阳性的实验菌株制备LT提取液，分别进行酶联免疫吸附实验和双向琼脂扩散实验，结果见表2。酶联免疫吸附实验灵敏度要高4倍。
表2  两种方法对LT的测定结果

方法               1:2        1:4      1:8       1:16        1:32

酶联免疫吸附             #          ++       ++         +           +

双向琼脂扩散             #          -        -          -           -

3 讨论
　　猪肉中大肠杆菌肠毒素（LT）是引起食用者腹泻的主要致病因子，可以分为热敏性肠毒素和耐热性肠毒素两类，它又是很强的免疫原，也具有很强的黏膜免疫佐剂作用，但LT的毒性限制了它在人类疫苗中使用[3]。为探索猪源大肠杆菌热敏感肠毒素的简易检测方法和纯化方法，本实验建立了检测产肠毒素性大肠杆菌肠毒素的酶联免疫吸附实验方法，实验证明此方法特异性强、重复性好。但影响ELISA非特异性反应的因素很多，除了 抗原纯度外，封闭液的选择也很重要。笔者曾分别采用10%的犊牛血清、2%的明胶、1%的牛血清白蛋白进行了封闭效果对比实验。结果表明阴性血清组犊牛血清的封闭效果最好，其次是牛血清白蛋白，明胶效果较差；阳性血清组明胶的封闭效果最好，其次是牛血清白蛋白，犊牛血清效果较差。原因不明。采用明胶均可得到良好的封闭效果。双向琼脂扩散实验是测定LT的经典方法，敏感性较高，但是有一定的局限性，这种方法耗时较长，效率不高，需要较多的实验食品。乳鼠生物学实验对LT敏感，而且重复性也较好，因此乳鼠实验被认为是测定ST的常规方法，但其检出不高且受很多因素制约。
4 参考文献
[1] 毛旭虎,邹全明,许霖水.大肠杆菌不耐热肠毒素的分子生物学特性[J].国外医学·临床生物化学与检验学分册,2000,21(5):228.
[2] Broeek W V,CoxE,Cudega B,et, F4 fimbrial antigen of Esherichia coli and its receptors[J].Vet Microb,2010,71(2):223.
[3] Guinee PAM,Jansen W or of Escherichia colik antigens K88ab,K88ac,and K88ad inimmuno eleetrophoresis,double diffusion,and hemagglutination[J].Inct Immun,2009,23(3):700.