抗人CD33单克隆抗体(HIM34、WM53、M195)抗原识别表

【摘要】 目的：确定抗人cd33单克隆抗体(him34、wm53、m195)抗原识别表位所在区域，进而阐明抗体识别表位不同于其介导的生物学作用之间的关系。方法：将四个cd33胞外区不同长度的基因片段定向克隆入真核表达载体pdisplay，构建成真核表达载体pdisplay/ep1、2、3、4，分别将空载体和构建的质粒通过磷酸钙沉淀法转染入293t细胞，瞬时转染48小时后利用流式细胞仪通过抗血凝素a（ha）抗体标记以检测各质粒在细胞表面的表达, 同时检测him34、wm53、m195和不同区段的结合活性。结果：抗人cd33单克隆抗体him34能识别pdisplay/ep1、2、3表达的蛋白，wm53能识别pdisplay/ep1表达的蛋白，m195则均能识别四个片段所表达的蛋白。结论：him34、wm53、m195识别的cd33抗原表位分别位于115～170、17～60、170～262氨基酸。

　

【关键词】 cd33 单克隆抗体 抗原表位 白血病

　　preliminary study of antigenic epitopes recognized by mab(him34,wm53,m195) against human cd33

　　zuo yufeng, wang min, tian zheng, chen ling, qu hao, wang li, wang jianxiang, liao xiaolong.

　　institute of hematology, chinese academy of medical sciences & peking union medical college, tianjin 300020, china
　　［abstract］ objective:to identify the regions of antigenic epitopes recognized by monoclonal antibodies(mab)(him34,wm53,m195) against human s:four different length gene fragments of human cd33 extracellular region were cloned in frame into the mammalian expression vector pdisplay. then these constructed and control plasmids were transfected into the 293t cells with calcium phosphatedna coprecipitation. fortyeight hours after transfection, the efficiency of transfection was analyzed by facs with the antiha（hemagglutinin a） regions of cd33 antigen recognized by anticd33 antibodies(him34,wm53,m195) were analyzed by facs s:the proteins expressed by pdisplay/ep1, 2 and 3 were recognized by mab him34. the proteins expressed by pdisplay/ep1 were recognized by mab wm53. the proteins expressed by pdisplay/ep1, 2, 3 and 4 were recognized by mab sion:the antigenic epitopes recognized by him34 are located in the amino acid residue(aar) 115170 of cd33 antigen. the antigenic epitopes recognized by wm53 are located in the aar 1760 of cd33 antigen. the antigenic epitopes recognized by m195 are located in the aar 170262 of cd33 antigen.

　　［key words］ cd33；monoclonal antibody；antigenic epitope；leukemia

　　him34、wm53、m195是不同克隆的抗cd33单克隆抗体。目前基础和临床研究较多的是人源化m195(hum195)，在hum195上连接肿瘤抗生素制备成gemtuzumab ozogamicin（go）或连接放射性同位素用于急性髓系白血病（aml）的治疗。2000年5月美国食品药品监督管理局（fda）批准了go上市，该药适用于年龄>60岁的首次复发及那些不能耐受化疗毒性的cd33+ aml患者，标志抗cd33抗体治疗aml进入了一个新阶段［1］。未标记的hum195特异地结合cd33后，除通过巨噬细胞的吞噬作用、激活补体及抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（adcc）来杀伤肿瘤细胞，最新的研究还提示抗cd33单克隆抗体还可以直接诱导白血病细胞发生凋亡［2］。wm53是美国bd公司的一株抗cd33单克隆抗体。him34是中国医学科学院血液学研究所免疫室制备的一株鼠源性抗cd33单克隆抗体igg1，并经过国际人类白细胞分化抗原协作组会议正式命名（国际编号为ⅴma112、ⅵma47）。前期的实验证明him34诱导白血病细胞发生凋亡的作用不明显。三株抗体都能特异性地识别髓系分化抗原cd33，但hum195等与cd33结合后能启动下游信号的传导，从而引发细胞发生一系列的生物学作用，而him34不具备这种作用。因为抗体的表位与其所介导的生物学活性间存在密切的联系，所以抗体这种差异可能是由特异性的表位所决定的，通过抗体竞争抑制试验也证实了三个抗体识别的表位是不同的。本研究的目的是确定三种抗体识别表位所在的区域并进行比较，进而阐明抗体识别表位的不同与其介导的生物学作用之间的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 菌株、质粒及细胞系 dh5α由本室保存，真核表达载体pdisplay购自美国invitrogen公司，人急性髓系白血病细胞系hl60、人胚肾上皮细胞系293t由本室冻存。

　　1.2 工具酶和主要试剂 限制性内切酶bgl ⅱ、sac ⅱ、pvu ⅱ、t4dna连接酶购自美国new england biolab公司；逆转录酶superscripttm ⅱ、高保真dna聚合酶pfx、trizo等购自美国invitrogen公司；鼠抗人单克隆抗体m195购自美国bd公司；fitc标记鼠抗人单克隆抗体him34、fitc标记羊抗鼠ig购自协和干细胞基因工程有限公司；pe标记鼠抗人单克隆抗体wm53购自美国bd公司；抗ha抗体购自美国cell signal公司。

　　1.3 引物设计与合成 从genbank数据库中搜索到人cd33分化抗原cdna序列，借助引物设计软件oligo 6.0设计四对引物（共5条，下游引物共用）以克隆四个cd33胞外区不同长度的基因片段ep1（全长胞外区17～262位氨基酸）、ep2（60～262位氨基酸）、ep3（115～262位氨基酸）、ep4（170～262位氨基酸），上游引物5′端引入bgl ⅱ酶切位点（划线部分），下游引物5′端引入sac ⅱ酶切位点（划线部分），引物序列如下，上游引物：ep1：5′gga aga tct tcc gat cca aat ttc tgg ctg c3′, ep2：5′gga aga tct tcc ttc cgg gaa gga gcc att at3′, ep3：5′gga aga tct tcc tac ttc ttt cgg atg gag aga gg3′, ep4：5′gga aga tct tcc cag gga aca ccc ccg atc tt3′，下游引物：5′tcc ccg cgg gga aat ggc ccc atg aac cag t3′。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

　　1.4 rtpcr扩增cd33胞外区四个不同长度的基因片段 利用trizo从表达cd33分化抗原的白血病细胞系hl60中提取rna，逆转录合成cdna后，分别扩增cd33胞外区四个不同长度的基因片段ep1、ep2、ep3、ep4，反应条件为：94℃预变性2分钟,94℃ 15秒, 58℃ 30秒, 68℃ 50秒,循环30次，最后72℃延伸10分钟。

　　1.5 重组质粒pdisplay/ep1、2、3、4的构建 将8 μg的质粒pdisplay以bgl ⅱ、sac ⅱ双酶切，电泳回收目的基因片段；另将4 μg的cd33胞外区基因片段ep1、2、3、4分别以上述酶进行双切，电泳回收目的基因，按1∶5的分子比取酶切后的质粒pdisplay和cd33胞外区基因片段用t4dna连接酶分别进行连接反应，用cacl2的方法转染 dh5α，接种于含氨苄青霉素的lb琼脂板上，37℃孵育过夜。

　　1.6 重组质粒的鉴定 挑取阳性质粒菌落，37℃振荡培养过夜，提取质粒，加rna酶消化rna后，用pvu ⅱ酶切，1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，阳性克隆可见到一约为600 bp和两个2.5 kb左右大小的片段。取酶切鉴定有插入片段的质粒送上海博亚生物有限公司进行dna测序。用qigen plasmid maxi kits大量提取质粒，进行纯化和质粒鉴定定量，保存于-20℃备用。

　　1.7 质粒转染 用磷酸钙沉淀的方法将pdisplay空载体及重组质粒pdisplay/ep1、2、3、4分别转染到293t细胞，瞬时转染48小时后收集细胞待测。

　　1.8 流式细胞仪检测各抗体识别的表位及ha的表达 在96孔板上每孔加上述细胞悬液10 μl，各含细胞数约1×106；对照孔和样品孔均加入10 μl ab血清，封闭非特异性结合；对照孔加20 μl含0.1%nan3的pbs，样品孔加20 μl抗ha抗体工作液，振荡混匀，置4℃冰箱中至少30分钟；用含0.1%nan3的pbs洗涤，1 000 r/min离心3～5分钟，弃上清；加fitc标记的兔抗鼠抗体工作液20 μl，振荡混匀，置4℃冰箱中不超过30分钟；用含0.1%nan3的pbs洗涤2次，方法同上，弃上清；用1%多聚甲醛150～200 μl 固定，置于4℃冰箱，待测；流式细胞仪检测各抗体识别的抗原表位及ha的表达。

　　2 结果

　　2.1 克隆cd33胞外区不同长度的基因片段 cd33分化抗原由364个氨基酸残基组成，其中1～17位氨基酸为信号肽；胞外区由241个氨基酸组成，我们扩增的基因片段ep1全长735 bp，包含了编码全长胞外区17～262位氨基酸基因序列。ep2缺失了胞外区17～59位氨基酸基因序列，全长606 bp包含了编码胞外区60～262位氨基酸基因序列。ep3缺失了胞外区17～114位氨基酸基因序列，全长441 bp包含了编码胞外区115～262位氨基酸基因序列。ep4缺失了胞外区17～169位氨基酸基因序列，全长276 bp包含了编码胞外区170～262位氨基酸基因序列。pcr扩增的cd33胞外区不同长度的基因片段在1%琼脂糖凝胶电泳结果，见图1。

　　2.2 pdisplay/ep14重组真核表达载体的构建 构建的重组载体表达cd33胞外区不同片段蛋白为融和蛋白，n端为小鼠igκchain的引导序列，接着是血凝素a （hemagglutinin a，ha）的表位，然后是cd33胞外区片段，c端为myc表位和pdgfr跨膜区，见图2。

　　2.3 重组质粒的鉴定 pvu ⅱ酶切阳性克隆，pvu ⅱ在质粒pdisplay的3 187和3 798各有一个酶切位点，而在cd33的544位上也有一个pvu ⅱ的酶切位点，用pvu ⅱ酶切，就会将重组质粒切成三个片段，一个为611 bp的小片段，另外两个2.5 kb左右的片段，电泳后酶切图谱与预期片段大小吻合，见图3。pdisplay/ep14各选取一个阳性克隆经dna测序后证明序列正确且为框内（in frame）插入，没有改变cd33胞外区不同片段蛋白序列及质粒pdisplay的编码序列。

　　图1 pcr扩增4个不同长度的cd33胞外区片段（略）

　　fig.1 pcr amplification of four different length fragments of cd33 extracellular region

　　note:2000 marker;1;2;3;4.

　　图2 重组表达载体pdisplay/ep14的构建示意图（略）

　　fig.2 schematic representation of construction of the recombinant expressed plasmid of pdisplay/ep14

　　图3 限制性内切酶酶切鉴定重组载体pdisplay/ep14（略）

　　fig.3 identification of the recombinant plasmids of pdisplay/ep14

　　note:1,3,5, plasmids of pdisplay/ep14 weren’t digested by the restriction enzymes of pvu ⅱ respectively;2,4,6, plasmids of pdisplay/ep14 were digested by the restriction enzymes of pvu ⅱ respectively;15000 marker;2000 marker.

　　图4 抗ha抗体检测各质粒编码基因在293t细胞膜表面的表达（略）

　　fig.4 identification of the expression of the proteins encoded by the plasmids on the membrane of 293t cells by antiha antibody

　　note:a.293t cells;ay/293t cells;ay/ep1/293t cells;ay/ep2/293t cells;ay/ep3/293t cells;ay/ep4/293t cells.

　　图5 流式细胞仪检测wm53与cd33抗原结合的区域（略）

　　fig.5 the region of cd33 antigen recognized by anticd33 antibodies wm53 was analyzed by facs

　　note:a.293t cells;ay/293t cells;ay/ep1/293t cells;ay/ep2/293t cells;ay/ep3/293t cells;ay/ep4/293t cells.

　　图6 流式细胞仪检测him34与cd33抗原结合的区域（略）

　　fig.6 the region of cd33 antigen recognized by anticd33 antibodies him34 was analyzed by facs

　　note:a.293t cells;ay/293t cells;ay/ep1/293t cells;ay/ep2/293t cells;ay/ep3/293t cells;ay/ep4/293t cells.

　　图7 流式细胞仪检测m195与cd33抗原结合的区域（略）

　　fig.7 the region of cd33 antigen recognized by anticd33 antibodies m195 was analyzed by facs

　　note:a.293t cells;ay/293t cells;ay/ep1/293t cells;ay/ep2/293t cells;ay/ep3/293t cells;ay/ep4/293t cells.

　　表1 抗cd33单克隆抗体与cd33胞外区不同片段结合活性（略）

　　tab.1 the different fragments of cd33 extracellular region recognized by anticd33 antibodies

　　2.4 cd33胞外区不同长度片段蛋白成功表达在293t细胞膜表面 瞬时转染48小时通过抗ha（hemagglutinin a）抗体标记后利用流式细胞仪检测ha在293t细胞表面表达情况，结果均为阳性，表明空载体和各质粒编码的重组蛋白成功表达在293t细胞表面，见图4。

　　2.5 三种抗人cd33单克隆抗体与cd33胞外区不同长度片段结合活性 瞬时转染48小时细胞通过him34、wm53、m195标记后流式细胞仪检测。结果wm53能识别pdisplay/ep1表达的蛋白,结合为阳性，其它均为阴性，见图5。him34能识别pdisplay/ep1、2、3表达的蛋白，不能识别pdisplay/ep4所表达的蛋白，见图6。m195则能识别所有pdisplay/ep14四个片段所表达的蛋白，见图7。

　　2.6 三种抗人cd33单克隆抗体抗原识别表位所在区域 单克隆抗体wm53、him34、m195识别的表位各不相同。wm53只能和pdisplay/ep1表达的完整的胞外区片段结合，him34能和pdisplay/ep13表达的片段结合， m195能和所有的pdisplay/ep14表达的胞外区片段结合，见表1。him34识别的cd33抗原表位位于115～170氨基酸残基。wm53识别的cd33抗原表位位于17～60氨基酸残基。m195识别的cd33抗原表位位于170～262氨基酸残基。

　　3 讨论

　　本实验通过pcr的方法扩增了cd33胞外区的四个片段，将这四个基因片段框内（in frame）插入到真核表达载体pdisplay上，这样构建的载体所表达的融合蛋白可以借助n端的鼠免疫球蛋白κ链引导序列使重组蛋白进行分泌性表达，同时借助c端的血小板衍生生长因子受体的跨膜区蛋白使重组蛋白锚定在细胞膜上，因此利用这一载体可以将cd33不同胞外区片段表达在cd33阴性的293t细胞表面。真核表达相对于原核表达或合成肽方法有许多优点，其中之一就是能够更好地模拟cd33胞外区的表达和表达后的修饰，比如糖基化等，从而尽可能的维持cd33原来的空间构象，因此能更加客观地反映抗人cd33单克隆抗体him34、wm53、m195识别的表位所在的区域。

　　对三种单克隆抗体识别表位的研究使我们进一步了解抗原抗体相互间作用的关系，有研究表明靠近细胞膜的表位对于抗原的功能可能更为重要［3］。在抗体的介导下抗原通过和本身或其他的功能分子交连，从而进一步发挥生物学作用。本试验表明m195的表位相对于其它两种抗体的表位更靠近细胞膜，从而进一步的证明了抗原表位的位置与其生物学功能有密切的关系。

　　本实验了解三种抗体识别表位的大致区域，从而比较三种抗体识别表位的异同，同时为进一步地精确表位作图打下基础。目前很多实验已经证明了hum195能够抑制白血病细胞的生长，诱导白血病细胞发生凋亡，因此可以以m195识别的表位为靶点，设计和筛选针对m195识别表位的髓系白血病的靶向治疗药物。目前我们对cd33的功能还不是很清楚［46］，作为一个特异性髓系分化抗原，我们不知道cd33是细胞生长分化过程中的一个“过客”，还是具有重要的作用，因此通过对抗体识别表位的研究特别是m195识别表位的研究，从而进一步了解cd33分化抗原的功能和作用。

【参考文献】
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　　4 crocker p r. siglecs:sialicacidbinding immunoglobulinlike lectins in cellcell interactions and signaling ［j］. curr opin struct biol, 2002;12(5):609615.