人参皂苷Rg1对体外培养胚胎神经干细胞增殖作用

【摘要】 目的 探讨人参皂苷rg1对体外培养胚胎神经干细胞增殖作用的影响。方法 从孕16天sd大鼠胚胎脑组织中分离培养胚胎神经干细胞,免疫组化法进行神经干细胞的鉴定及增殖鉴定,采用稀释法筛选和检测人参皂苷rg1对体外培养胚胎神经干细胞增殖作用的影响。结果 剂量筛选结果显示,人参皂苷rg1组(100、4、0.8 μmol/l)神经球数明显增加。选定人参皂苷rg1 40、4、0.4 μmol/l作为高、中、低剂量进行进一步实验研究,与对照组相比,人参皂苷rg1高、中、低剂量组神经球生成数目明显增加。结论 人参皂苷rg1可以明显增加神经球生成数目,具有促进胚胎神经干细胞体外增殖的作用。

【关键词】 人参皂苷rg1;胚胎神经干细胞;增殖

　effects of ginsenoside rg1 on the proliferation of neural stem cells cultured in vitro zhou zhi-huan, wang xiu-yun, zhong pei-ru, et al (tianjin university of tcm, tianjin 300193, china)

　　abstract：objective to explore the effect of ginsenoside rg1 on proliferation of neural stem cells (nscs) in vitro. methods the nscs cultures were generated from the brain of embryonic day 16 sd rat. primitive nscs were cultured, proliferated and passaged. the nscs were identified by the immunocytochemical (icc) staining of nestin. the icc staining of brdu was adopted to characterize the proliferation of nscs. according to limited dilution method, the effect of ginsenoside rg1 on the proliferation of nscs was observed. results the nscs were successfully cultured and proliferated in vitro. different dosages (100, 4, 8 μmol/l) of ginsenoside rg1 could promote the proliferation of nscs in vitro. compared with the control group, the numbers of nerurospheres of the three dosage ginsenoside rg1 groups (40, 4, 0.4 μmol/l) were increased obviously. conclusions ginsenoside rg1 significantly promote the proliferation of nscs in vitro.

　　key words：ginsenoside rg1;embryonic neural stem cells;proliferation

　　神经干细胞(neural stem cell,nscs)具有自我更新能力和多向分化潜能[1],在神经系统疾病或损伤的修复中起着重要的作用。研究调节nscs增殖分化的影响因素,诱导其增殖和定向分化为中枢神经系统损伤修复和退行性变的治疗带来了希望。因此,nscs的体外培养、增殖、诱导定向分化的研究已成为神经科学的一个研究热点。本研究对体外培养胎鼠nscs进行增殖鉴定,观察了人参皂苷rg1对nscs增殖能力的影响,为开发对nscs具有保护效能的治疗药物、探索神经系统疾病新的治疗方法打下基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 培养基、试剂及药物

　　dmem/f12(1∶1)培养基( atb31223,hyclone,u.s.a);hbss液(无钙离子和镁离子, 01118197,lonza,u.s.a);b27添加物( 311624,gibco/invitrogen);青霉素-链霉素溶液(双抗,100×)(每毫升含有10 000 u青霉素以及10 mg链霉素, p4333,sigma);重组人碱性成纤维细胞生长因子(bfgf, cyt-218,prospec-tany,israel);人表皮生长因子(egf)( 3860501000,strathmann biotec,germany);人参皂苷rg1、丹酚酸b(天津中一制药)。

　　1.2 大鼠胎鼠神经干细胞原代培养及传代

　　取孕龄16天孕鼠,脱臼处死,75%乙醇浸泡消毒3～5 min,无菌条件下打开腹腔,取出串珠状子宫,浸泡于冷hbss液中。取出胎鼠,置于另一含有冷hbss液的培养皿内,小心剥离外层骨膜,取出大脑皮质并去除软脑膜,冷hbss液漂洗2次后,转移至离心管。加入一定量冷hbss液后吹打至肉眼看不到明显组织块,使液体呈均匀悬浊状。过200目(70 μm)筛网,1 000 r/min离心8 min,弃上清,全培基(含2%b27、20 μg/l bfgf、20 μg/legf的dmem/f12,1%双抗)重悬,约3～4个胎鼠/75 cm2的密度种入培养瓶中,37 ℃、5%co2培养箱中培养。每2～3 d半量换液,收集培养液到50 ml离心管中,静置3～5 min,然后收集上清(管底约留1～2 ml)转入另一离心管,500 r/min离心3 min。弃约一半上清液,补充入相同量的新鲜的全培基(含1%双抗, 2%b27、20 μg/l bfgf、20 μg/l egf的dmem/f12),重悬种置。

　　约5～9 d传代1次。500 r/min 离心3 min,收集培养的神经球,沉淀细胞用1 ml全培基重悬,用23号(内径0.65 mm)注射器轻轻吹打5次,避免产生气泡,静置3～5 min使未吹散的细胞沉底。收集上清,管底的细胞再加1 ml继续吹打5～8次,收集细胞补加全培基,以1×105个/ml的密度全培基重悬种入培养瓶或培养板。

　　1.3 神经干细胞及增殖鉴定

　　采用abc法进行nestin免疫组化染色鉴定nscs。染色步骤：盖玻片放入6孔板内,每孔加多聚赖氨酸处理60 min;将细胞悬液接种于多聚赖氨酸处理过的盖玻片的6孔板内,贴壁生长2 h;4%多聚甲醛固定20 min;3%h2o2 37 ℃,30 min;加入封闭血清,37 ℃孵育30 min;甩去余液;滴加anti-nestin抗体(阴性对照不滴加一抗),4 ℃过夜;滴加生物素标记的二抗,37 ℃孵育30 min;滴加abc复合物,室温孵育30 min;滴加dab显色2 min;50%甘油封片,显微镜下观察照相。

　　用brdu标记nscs进行增殖能力的鉴定。染色步骤：盖玻片放入6孔板内,每孔加多聚赖氨酸处理60 min;将细胞悬液接种于含多聚赖氨酸处理过的盖玻片的6孔板内,贴壁生长2 h;4%多聚甲醛固定20 min;0.3%h2o2 37 ℃,30 min;2 mol/l hcl,37 ℃变性30 min;0.1 mol/l硼酸中和2次,每次10 min;加入封闭血清,37 ℃孵育15 min,甩去余液;滴加单克隆anti-brdu抗体(阴性对照不滴加一抗),4 ℃过夜;滴加生物素标记的二抗,37 ℃孵育1 h;滴加abc复合物,室温孵育30 min;滴加dab显色2 min;50%甘油封片,显微镜下观察照相。

　　1.4 稀释法筛选人参皂苷rg1对体外培养胚胎神经干细胞增殖作用

　　将nscs克隆球制成1×105个/ml的细胞悬液,将该细胞悬液稀释240倍,加入不同剂量的中药(人参皂苷rg1)种入2个24孔板,每组4孔。第一板实验分组为：对照组、丹酚酸b组(0.035 μmol/l)、人参皂苷rg1组(浓度分别为100、20、4、0.8 μmol/l);第二板的实验分组为对照组、丹酚酸b组(0.035 μmol/l)、人参皂苷rg1组(浓度分别为10、2、0.4、0.08 μmol/l)。常规培养4 d后对神经球进行计数(包含细胞≥5)。

　　1.5 稀释法检测人参皂苷rg1对体外培养胚胎神经干细胞增殖作用

　　将nscs克隆球制成1×105个/ml的细胞悬液,将该细胞悬液稀释240倍,加入不同剂量的中药(人参皂苷rg1)种入24孔板,共5组,每组4孔。实验分组为对照组、丹酚酸b组(0.035 μmol/l)、人参皂苷rg1组(浓度分别为40、4、0.4 μmol/l)。常规培养4 d后对神经球进行计数(包含细胞≥5)。

　　1.6 统计学方法

　　实验数据用x±s表示,采用spss11.5统计软件作方差分析,进行组间比较。

　　2 结果

　　2.1 神经干细胞培养鉴定及增殖鉴定

　　对传代nscs进行nestin染色,细胞胞浆呈棕黄色,为阳性(细胞阴性对照则不被黄染),表明本实验所培养细胞为nscs。对传代nscs进行brdu标记后染色,与brdu阴性对照比较, nscs细胞核被黄染,表明经传代后nscs依然具有体外分裂增殖能力。nscs鉴定结果见图1。

　　nestin普通染色(阳性) nestin普通染色(阴性对照)

　　brdu普通染色(阳性) brdu普通染色(阴性对照)

　　图1 nscs增殖鉴定

　　2.2 人参皂苷rg1对体外培养胚胎神经干细胞增殖作用的剂量筛选(见表1、表2)

　　与对照组相比,人参皂苷rg1 4 μmol/l以及0.8 μmol/l组神经球数明显增加,差异有统计学意义(p<0.01);人参皂苷rg1 100 μmol/l组神经球数明显增加,差异有统计学意义(p<0.05);其他剂量组神经球生成数目没有明显改变。通过实验结果分析,拟选定人参皂苷rg1 40、4、0.4 μmol/l作为高、中、低剂量进行进一步实验研究,重复3次。表1 人参皂苷rg1对神经球生成数目影响的剂量筛选(第一板)表2 人参皂苷rg1对神经球生成数目影响的剂量筛选(第二板)

　　2.3 不同剂量人参皂苷rg1对体外培养胚胎神经干细胞增殖作用的影响(见表3)表3 不同剂量人参皂苷rg1对神经球生成数目的影响(x±s)

　　第1次实验结果显示,与对照组相比,人参皂苷rg1中、低剂量组神经球数生成数目明显增加,差异有统计学意义(p<0.01)。第2次实验结果显示,与对照组相比,人参皂苷rg1高、中剂量组神经球生成数目明显增加,经统计学分析,差异有统计学意义(p<0.05),人参皂苷rg1低剂量组神经球生成数目明显增加,差异有统计学意义(p<0.01)。第3次实验结果显示,与对照组相比,人参皂苷rg1高、中、低剂量组神经球生成数目明显增加,差异有统计学意义(p<0.01)。

　　3次实验结果综合分析表明,人参皂苷rg1可以明显增加神经球生成数目,具有促进胚胎神经干细胞体外增殖的作用,其中以低剂量(0.4 μmol/l)作用更为显著(均p<0.01)。

　　3 讨论

　　nscs具有在成体中枢神经系统中可分化为神经元的能力,改变了以往神经科学的固有观念,在临床和神经医学领域受到了普遍关注。nsc培养体系的建立和完善,使nsc增殖、分化以及迁移得以迅速发展。目前,对nscs的增殖研究国内外大部分集中于细胞因子对nscs的影响,利用传统中药内源性诱导nscs研究较少。中药的神经保护作用广泛且具有机制的多样性,因此,应用中药诱导nscs的增殖,促进神经再生和神经功能的修复与重建,可望为中药治疗缺血性脑损伤开辟全新的治疗途径。

　　人参是传统的补气中药,人参在许多神经系统疾病如阿尔茨海默病、帕金森病、周围神经损伤的治疗中,发挥着积极的作用[2]。人参皂苷rg1是人参活性成分中已提纯的单体成分,是人参中主要活性成分之一。人参皂苷rg1主要药理作用为改善微循环、提高组织抗缺氧能力,具有ca2+拮抗作用、抗疲劳作用,改善学习记忆技能,促进dna、rna和蛋白质合成作用,对中枢神经有兴奋作用。rg1因亦存在于三七当中,故其活血消瘀、改善循环、抑制血小板聚集的作用也很明显[3]。

　　本研究选取补气健脑生药提取成分人参皂苷rg1,考察其对nscs增殖的诱导作用机制。通过体外培养大鼠胚胎nscs,免疫组化法进行nscs的鉴定及增殖鉴定,表明本试验所培养细胞为nscs,对传代nscs进行brdu标记后染色,与brdu阴性对照比较,nscs细胞核被黄染,表明经传代后nscs依然具有体外分裂增殖能力。本研究证实了具有补气健脑作用的中药有效成分人参皂苷rg1可以作用于nscs,对nscs的增殖有明显的诱导促进作用。人参皂苷rg1高、中、低剂量均明显增加神经球的生成数目,以低剂量作用更为显著。表明临床可预期应用以补气为主的人参皂苷rg1诱导nscs的增殖和定向分化,为许多疑难脑病的治疗提供新的选择。

【参考文献】
　[1] gage fh. mammalian neural stem cells[j]. science,2000,287：1433.

　　[2] 陈 滢,陈晓春.bcl-2家族是人参皂甙rg1抗黑质神经元凋亡的重要调控蛋白[j].解剖学报,2002,33(5)：496-499.

　　[3] michael s, bahrke, william pm. evaluation of the ergogenic properties of ginseng：an update[j]. sports med,2000,29(2)：113-133.