靳三针疗法对窒息脑瘫幼鼠神经干细胞增殖与分

作者：刘乡,柴铁劬,孙娟,张瑞 孟令杰,赵丹,周健洪,陈东风

【摘要】 【目的】观察靳三针疗法对脑瘫大鼠神经干细胞(nscs)增殖与分化的影响。【方法】选用sd新生大鼠,随机分为假手术组、模型组、靳三针疗法治疗组(治疗组,针刺百会、颞ⅰ针、曲池、内关、足三里、涌泉),模型组与治疗组均采用结扎单侧颈总动脉法复制脑瘫大鼠模型,其中治疗组于手术后24 h开始针刺,共14 d。各组于造模后15 d处死大鼠制备脑组织提取液。另取健康sd新生大鼠,取大脑海马部位,分离、扩增nscs,采用免疫细胞化学法检测nscs 特征性标记nestin与brdu表达,以鉴定培养的细胞及体外分化能力。培养细胞分为正常对照组,低、高浓度组(分别加入100、300 μl/ml的治疗组脑组织提取液),培养1、3、5 d后,采用免疫细胞化学法和免疫荧光法检测各组神经元样细胞和星形胶质样细胞的特征性标志物神经丝蛋白(nf)和胶质纤维酸性蛋白(gfap)的表达,观察各组nscs分化情况。采用流式细胞术检测各组nf、gfap阳性细胞数,观察脑组织提取液促进nf、gfap表达的时效和量效关系。【结果】扩增后的细胞球nestin与brdu均呈阳性,证实体外培养的细胞为nscs ,并处于分裂增殖旺盛期。细胞培养1、3、5 d后,nf、gfap 染色均呈阳性,且正常对照组阳性细胞少,低、高浓度组明显增多,呈浓度依赖性,表明nscs 已分化为神经元细胞和星形胶质细胞。同一时间段内低、高浓度组nf、gfap阳性细胞数均较正常对照组显著增高(p<005 或p<001),高浓度组在培养1、3、5 d后,nf、gfap阳性细胞数也显著增高(p<005 或p<001),表明治疗组脑组织提取液可促进nf、gfap表达,且呈一定的量效和时效关系。 【结论】靳三针疗法治疗脑瘫可能是通过促进nscs的增殖和定向分化,从而达到修复脑损伤的目的。

【关键词】 靳三针疗法/治疗应用;脑性瘫痪/针灸疗法;神经干细胞/病理学;细胞培养

　　脑性瘫痪(cerebral palsy, cp)是小儿先天性或围产期所发生的脑功能障碍性综合征,以中枢性运动障碍及姿势异常为主,常伴发智力低下、癫痫、语言障碍、视听异常等多重残障,是继脊髓灰质炎被控制后近代最常见的儿童致残性疾病[1] 。目前国内外多种cp康复手段虽有一定疗效,但仍无明显突破。“靳三针疗法”是著名针灸学家靳瑞教授经多年临床实践,汲取古代针灸配穴理论而创造的具有独特理、法、方、穴、术的针灸疗法,对cp患儿多种症状改善有良好的临床效果[2-3]。

　　神经干细胞(neural stem cells ,nscs)是脑内具有自我复制能力和多向分化潜能的细胞团,在脑损伤后可以被激活并增殖、迁移及分化,使损伤造成的形态与功能上的缺失得以部分恢复[4]。因此,通过某些干预治疗措施诱导、增强自体神经干细胞的增殖,调节其定向分化,以促进自身修复，这已成为治疗脑瘫新的研究热点。本实验采用“靳三针”针刺后的窒息脑瘫幼鼠模型脑组织提取液进行神经干细胞培养,观察该法对神经干细胞增殖与分化的影响,现报道如下。

　　1材料与方法

　　11主要试剂及仪器dhanks液、ldmem、1 mol/l胰蛋白酶、胎牛血清(fbs)由gibcol 公司提供，链霉亲和素生物素复合物(sabc)、二氨基联苯胺(dab)染色试剂盒由武汉博士德公司提供，神经丝蛋白(neurofilament, nf)、神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,gfap)、nestin and brdu试剂盒由基因公司提供。高速冷冻离心机(美国)，olympus 显微镜(日本)，bd facsc alibur全自动流式细胞仪(美国)，超净工作台(苏州净化设备公司)，电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械一厂)。

　　12实验动物及造模[5]清洁级健康sd新生大鼠18只,由广州中医药大学实验动物中心提供(粤检证字2003a010号)。sd大鼠被随机分为假手术组、模型组、靳三针疗法治疗组(简称治疗组),每组各6只。麻醉状态下结扎大鼠(模型组、治疗组)左侧颈总动脉,2 h后吸入体积分数8%氧和92%氮的混合气体2 h(1 l/min),继续保温1 h后做行为测定,翻身不能、平衡异常、左旋者视为造模成功,以母鼠哺育。假手术组仅分离颈总动脉而不结扎,亦不作低氧处理。

　　13各组处理方法模型组手术后不做任何处理。治疗组于手术后24 h开始针刺。穴位：百会、颞ⅰ针、曲池、内关、足三里、涌泉。定位方法：参照《大鼠穴位图谱研制》[6],结合人与动物骨度类比,顶骨正中定为百会穴;脑损伤侧外耳道口直上08 cm处模拟颞三针之颞ⅰ针;桡骨近端关节外侧前方的凹陷中取曲池穴;前肢内侧,离腕关节约3 mm左右,尺桡骨缝间取内关穴;足三里穴(即后三里)在膝关节后外侧,腓骨小头下约5 mm处;后肢掌心前正中取涌泉穴。针刺方法：头部穴位平刺,进针后觉针下沉紧即可,百会、颞ⅰ针接电针仪,连续波,频率5～10 hz,以穴周组织轻微抖动为度,约3～5 v,持续5 min。曲池、后三里穴用02寸毫针,针1分深左右,亦施电针,参数同上。内关、涌泉速刺微出血,不留针。手术后前7 d仅针四肢部穴位,第8天开始加针头部穴位。每天针刺1次,共14 d。

　　14脑组织提取液的制备[5]各组于造模后15 d处死,取脑损伤区大脑皮质,按每150 mg脑组织湿质量加1 ml冷冻tyrode平衡溶液的比例制备匀浆,匀浆液于4℃冰箱内过夜,次日冷冻离心15 000 r/min共30 min,取上清液过滤除菌,各相同组别之上清液混合,静置备用。

　　15神经干细胞分离、扩增与鉴定另取1只健康sd新生大鼠,在无菌条件下取出其大脑,放入dhanks液中分离出海马,将之剪碎置于离心管中,以1 000 r/min离心5 min,吸去上清液,再加入1 mol/l胰蛋白酶消化10 min,用含体积分数10%胎牛血清的培养基终止消化。随后离心5 min,吸去上清液,加入dmem/f12的无血清培养基,用吸管吹打成单细胞悬液,过滤,细胞计数。以1×105/ml的细胞密度移入培养瓶中培养,每隔3 d半量置换培养基。培养7 d后,机械分离神经球进行传代,并用brdu检测神经球内细胞的增殖能力,在培养液中加入05 mol/l brdu处理24 h,然后进行免疫细胞化学染色,以nestin作为nscs的特征性标记物对培养的nscs进行鉴定,检测nscs的分化能力。

　　16nscs的分组培养收集培养的第2代神经球,以2×105/cm2的细胞密度接种于预先用100 mg/l多聚赖氨酸处理过的24孔培养板各孔中的盖玻片上和6孔培养板中。每块培养板分为正常对照组,低浓度组和高浓度组,每组6孔。正常对照组培养液用dmem/f12,加体积分数10%胎牛血清配制。低浓度组、高浓度组是在正常对照组培养液的基础上加入治疗组的脑组织提取液,浓度为100 μl/ml和300 μl/ml。将培养板置饱和湿度、体积分数5%co2培养箱37℃培养。每隔3 d半量置换培养液,培养1、3、5 d。24孔培养板细胞做免疫细胞化学染色和免疫荧光检测,6孔培养板细胞做流式细胞仪测定。

　　17检测指标神经干细胞分化检测：在分别培养1、3、5 d后,取出24孔培养板各孔中的盖玻片,用40 g/l多聚甲醛固定30 min,001 mol/l磷酸盐缓冲液(pbs)冲洗后,检测nf、gfap表达。

　　171免疫细胞化学染色细胞爬片以新鲜配置的体积分数3%h2o2室温浸泡5～10 min,以灭活内源性过氧化物酶。滴加正常山羊血清30 min,分别滴加鼠抗nf、gfap、nestin and brdu一抗(1∶2000),恒温下(37℃)孵育2 h,pbs洗,滴加生物素化山羊抗小鼠igg室温下30 min,滴加试剂sabc,室温30 min,dab显色,室温下20 min,脱水、透明,中性树胶封片。染色对照：同一组片中,分别用正常山羊血清和pbs代替nf、gfap、nestin and brdu一抗作孵育,其余步骤同上。

　　172免疫荧光反应细胞爬片用40 g/l多聚甲醛固定15 min,再经体积分数为3%的过氧化氢—甲醇溶液中室温浸泡10 min,正常山羊血清封闭20 min,分别加入nf、gfap一抗在4℃过夜。与生物素化的二抗37℃下孵育20～30 min,再与链霉亲和素生物素复合物—异硫氰酸荧光素(sabcfitc)在37℃下孵育20 min,碘化丙啶(propidium iodide, pi)复染。

　　173流式细胞仪定量分析nf和gfap阳性细胞数以胰酶消化离心收集细胞,用pbs洗1次,体积分数70%乙醇固定20 min,离心去乙醇,pbs洗1次,1 ml pbs悬浮细胞分别加nf和gfap抗体(1∶200稀释),在4℃冰箱内孵育过夜,离心去上清,pbs洗1次,加sabcfitc室温下孵育1 h,离心去上清,pbs洗1次,取1 ml pbs悬浮细胞，采用流式细胞仪测定nf和gfap阳性细胞数。

　　18统计学方法在10×20荧光显微镜下,对免疫细胞化学染色的阳性细胞进行计数。每组有6个培养神经干细胞的盖玻片,每个盖玻片上随机选5个计数单位面积,计算细胞总数和阳性细胞数及阳性细胞的百分率。采用spss 100统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(x±s)、中位数(m)表示，组间比较采用方差分析(非正态或方差不齐采用秩和检验)，检验水平α=005。

　　2结果

　　21体外培养神经干细胞结果在培养最初3 d中,可见少量细胞贴壁生长,培养基中悬浮大量未贴壁的单细胞和小细胞团。小细胞团逐渐增大,第6天即形成含有数10个细胞的圆形细胞球,部分贴壁,部分仍处于悬浮状态。贴壁生长的细胞球有少量细胞向外周迁移,伸出突起彼此交织成网状,形似细胞球周边长出的细长突起,放射状向四周伸展呈神经球样生长的原代培养nscs形态，见图1(彩图见第315页)。随着培养时间延长,细胞球继续增大,细胞迁移逐渐增多。对不同时间培养获得的神经球进行免疫细胞化学鉴定,克隆内的细胞及周边细胞均呈nestin阳性，见图2-a(彩图见第315页),证明神经球细胞属于胚胎早期原始细胞,因为nestin的表达起始于神经板形成时期的细胞,发育到神经元迁移及分化后逐渐消失。brdu是细胞增殖阶段的特征性标记,孵育后的神经球经免疫细胞化学鉴定大多数细胞呈brdu阳性，见图2-b(彩图见第315页),表明这些细胞处于分裂增殖旺盛期,显示了自我更新能力,进一步证实本方法体外培养的细胞为神经干细胞。

　　22各组免疫细胞化学染色结果在细胞培养1、3、5 d后,神经干细胞可分化为gfap染色阳性的星形胶质样细胞，见图3(彩图见第315页)，以及nf染色阳性的神经元样细胞，见图4(彩图见第316页)。nf阳性神经元样细胞的胞体呈圆形或锥体形,突起有较多分支;gfap阳性星形胶质样细胞的胞体扁平,突起有较少分支,且突起长而直。

　　23各组免疫荧光检测结果正常对照组的nf、gfap阳性细胞少,低、高浓度组nf、gfap阳性细胞均明显增多,且呈浓度依赖性。3组nf、gfap阳性细胞的胞核均呈红色荧光,胞体呈绿色,数量呈剂量依赖性增多，见图5、图6(彩图见第316页)。

　　24流式细胞检测结果表1结果显示：在同一时间段内低浓度组、高浓度组nf阳性神经元样细胞和gfap阳性星状胶质样细胞的百分率均较正常对照组显著增高(p<005或p<001),并呈浓度依赖性。为了观察脑组织提取液对nscs分化过程中nf、gfap影响的时效性,用300 μl/ml即高浓度脑组织提取液分别作用0、1、3、5 d,表2结果显示：作用1 d后,nf、gfap阳性反应细胞开始显著增多,随着作用时间增加,nf表达增强。作用5 d后,nf、gfap阳性反应细胞达峰值,与不同培养时间点比较,nf、gfap阳性细胞的百分率随培养时间的延长而显著增加(p<005或p<001)。表1各组对nscs的nf、gfap表达的影响表2高浓度脑组织提取液于不同时间对nscs的nf、gfap表达的影响

　　3讨论

　　自1992年起,reynolds[7-8]等学者首先利用neuroshere 法成功地从成年鼠纹状体分离得到神经干细胞(nscs),并发现其在一定条件下可分化为神经系统的3种主要细胞(神经元细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞),具有自我复制能力和多向分化潜能。之后,中枢神经发育和再生研究的焦点集中在nscs上并取得了长足的进展。在胚胎脑的广泛区域和成年脑的一些特定区域内均有nscs的存在。发育期的脑较之成年脑含有更为丰富的nscs,随年龄增长,nscs数目逐渐减少。而nscs正常情况下处于休眠状态,基本没有分裂和分化现象。在损伤和局部环境变化时会被诱导分裂、分化、增生,如脑缺血、各种生长因子等都可成为诱发因素[9]。说明可通过改变微环境来影响干细胞的存活、迁移和分化,以得到所需要的特殊表型的神经元或胶质细胞。脑瘫脑损伤后,nscs有一定的自我修复潜能。中枢神经系统的移植实验也表明,某些部位的神经细胞或分裂后的神经元能够部分重建神经环路和功能[10-13]。但这种自我诱导的强度、持续时间是极为有限的,远远不能满足脑组织修复的需要。因此,nscs作为新生神经细胞的来源,可以通过nscs的体外移植或体内nscs的激活,使其分化为神经元和胶质细胞,与已经存在的细胞结构整合到一起,从而给中枢神经系统损伤的治疗带来了希望。

　　靳三针疗法是临床治疗脑瘫的有效手段,以疏通气血、益精填髓、醒脑开窍为治疗原则。前期研究已证实[14],靳三针治疗可增强脑缺血幼鼠脑组织超氧化物歧化酶(sod)及谷胱甘肽过氧化酶(gshpx)的活性,清除过氧化脂质(lpo),减轻自由基的损害,靳三针对脑瘫脑损伤后脑组织局部微环境中的多种因素有良性调节作用。本实验结果证实,经靳三针治疗后提取的脑瘫大鼠脑组织提取液能促进nscs向神经细胞和胶质细胞分化,显著提高nf、gfap表达的阳性率,“靳三针疗法”治疗脑瘫可能是通过促进神经干细胞的增殖与定向分化,从而达到修复脑损伤的目的。另有研究认为[15]脑损伤并不直接导致nscs的活化增殖,而可能是由于脑细胞或浸润的炎细胞释放了某些因子,后者促进基因活化从而触发了残存的原始神经细胞nestin蛋白重新表达。据此,我们推测,靳三针治疗脑性瘫痪的有效性更深层次的原因可能是通过针刺的良性诱导,促进了一系列细胞因子的产生与释放,从而改善了nscs所赖以生存的脑内微环境,并进一步促进nscs增殖与定向分化,最终达到修复脑瘫脑损伤的目的。因此,启动并增强nscs的自我修复能力可能是靳三针治疗脑性瘫痪的主要机制。其确切机制有待进一步研究证实。

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