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秦艽总苷对人肝癌细胞SMMC-7721体外作用的研究

发布时间:2015-07-08 10:15

【摘要】 目的观察秦艽总苷对肝癌细胞增殖及凋亡的影响。方法mtt法检测秦艽总苷对人肝癌smmc-7721细胞生长的影响,流式细胞仪分析细胞凋亡率,瑞-姬氏染色观察细胞形态变化。结果秦艽总苷浓度为125,250, 500,1 000 μg/ml时,smmc-7721细胞的生长受到不同程度的抑制,且有时间和浓度依赖性;流式细胞术检测显示一定浓度的秦艽总苷可诱导smmc-7721细胞凋亡;倒置显微镜下smmc-7721细胞出现细胞凋亡的形态学改变。结论一定浓度的秦艽总苷对人肝癌细胞smmc-7721有抑制增殖和诱导凋亡的作用。

【关键词】 秦艽总苷;smmc-7721细胞;凋亡

中药秦艽味苦、辛,性平,具有清热、除湿、止痛的功效。关于秦艽药理学方面的研究证明,秦艽具有抗炎、抗菌、抗病毒、解热、镇痛、免疫调节、保肝利胆等作用[1~9]。本研究以人肝癌细胞smmc-7721为研究对象,观察秦艽总苷对smmc-7721细胞的生长、细胞凋亡以及形态方面的影响,并以龙胆苦苷(>99%)作对照,比较相同浓度下对细胞作用的强弱。现报道如下。

  1 材料与仪器

  1.1 样品

  秦艽总苷(艽龙胶囊)购自西安正大制药有限公司,龙胆苦苷标准品(>99%)购自上海华美工程公司。秦艽总苷用pbs溶解,20 μl过滤除菌,获1 g/ml储备液备用;龙胆苦苷用pbs溶解,20 μl过滤除菌,获104 μmol/l备用。

  1.2 细胞系

  smmc-7721细胞由南京中医药大学药理实验室提供。

  1.3 试剂

  胎牛血清购自杭州四季青生物有限公司,dmem培养液购自gibco公司,annexinv-fitc凋亡试剂盒购自凯基生物科技发展有限公司,瑞-姬氏染液购自南京建成生物工程研究所。

  1.4 仪器

  细胞培养箱(ht151)购自上海力申科技有限公司,酶联免疫检测仪(sunrise)购自瑞士tecan公司,bd facscalibur流式细胞仪购自北京希尔诚兴业科技有限责任公司。

  2 方法

  2.1 smmc-7721细胞培养

  smmc-7721细胞用含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素、100 mg/ml链霉素的dmem培养液,在37℃、5%co2、饱和湿度的恒温培养箱中培养。待细胞达80%~90%融合状态时用0.25%胰蛋白酶消化后传代。实验期间不断冻存细胞,实验时取指数生长期细胞。

  2.2 细胞生长情况测定

  细胞用0.25%胰蛋白酶消化后,用dmem培养液调细胞浓度为104个/l,每孔90 μl接种于96孔培养板内,分别加入10 μl 31.25, 62.5,125, 250, 500,1 000 μg/ml 的秦艽总苷,设6个复孔。并设立加104 μmol/l的龙胆苦苷对照组,加pbs的阴性对照组。培养24, 48, 72 h后加入5 mg/ml的mtt 20 μl继续培养4h,吸弃孔内培养液后每孔加入dmso 100 μl,使结晶充分溶解,酶标仪测其吸光度,波长550 nm。细胞生长抑制率(%)=(1-药物组吸光度/阴性对照组吸光度)×100%。

  2.3 流式细胞仪测定

  smmc-7721细胞凋亡情况用上述方法将细胞浓度调为105/l,每孔2 700 μl接种于6孔培养板内,分别加入300 μl的1, 5,10 mg/ml的秦艽总苷,设立3个复孔,并设立加104 μmol/l的龙胆苦苷为阳性对照组,加pbs为阴性对照组。继续培养48 h后,吸弃孔内培养液,收集细胞,离心,用pbs洗2次,加入500 μl的binding buffer悬浮细胞,加入5 μl annexin v-fitc混匀后,加入5 μl propidium iodide, 混匀,室温、避光、反应15 min后在上机检测细胞凋亡。

  2.4 瑞-姬氏染色观察

  细胞形态将盖玻片置于六孔板内,分别2 700 μl 106个/l的细胞悬液,加入1 000 μg/ml 的秦艽总苷300 μl, 并设立阴性对照组,继续培养48 h,吸弃孔内培养液,取出盖玻片平置于染色架上,滴加复合染液3~4滴,使其迅速盖满盖玻片,染色1 min后滴加缓冲液6~10滴,轻摇玻片,使其充分混合,5~7 min后自来水冲去染液,待干后于光学显微镜检查。

  2.5 统计学处理

  采用spss 15.0进行数据处理。

  3 结果

  3.1 秦艽总苷对smmc-7721细胞增殖的影响

  结果见表1。由表1可见,秦艽总苷浓度为31.25,62.5 μg/ml时无抑制作用,而在125, 250, 500,1 000 μg/ml时有一定的抑制作用,其抑制率随浓度和时间而呈上升趋势(p<0.05),与同浓度的龙胆苦苷相比秦艽总苷抑制率较大。
表1 秦艽总苷对smmc-7721细胞增殖的影响(略)

  3.2 不同浓度秦艽总苷对细胞凋亡的影响

  结果见表2及图1~2。随着秦艽总苷浓度的增加,早期凋亡期细胞比率增加。表2 不同浓度秦艽总苷对细胞凋亡的影响(略)

  3.3 细胞形态学观察

  瑞-姬氏染色显示,阴性对照组smmc-7721细胞增殖活跃,分裂期细胞多见,细胞核呈类圆形,边界清,染色质均匀分布呈浅蓝色,核仁明显(2~3)个,细胞有伪足使细胞形态不规则,细胞密度高(见图3)。秦艽总苷作用后48h后,smmc-7721细胞形态发生明显变化,细胞密度降低并出现凋亡细胞,细胞体积变小,细胞核固缩,核仁消失,核染色呈紫蓝色。见图4。

  4 讨论

  肿瘤是严重威胁人类健康的一类常见疾病,多发病。临床治疗肿瘤西医一般采用手术、放疗、化疗三大疗法,疗效快捷,确有根治效果,但往往有明显的损伤和毒副作用。因此,寻找有效且无损伤和毒副作用的抗癌药物与方法,彻底攻克癌症,是世界医学界重要的研究课题。通过长期的研究和探索,中医药治疗肿瘤已取得了很大进展,而且中药材自然资源丰富、品种繁多、毒副作用低、价格低廉、为抗肿瘤较为理想的药物。许多国内外学者从天然药物筛选到有效单体提取做了大量研究,显示了中医药治疗肿瘤的独特优势。中医学认为,热毒是肿瘤发生、发展的一个重要因素。实验研究提示清热解毒中药通过抑制细胞增殖、诱导凋亡、分化及逆转、调节机体免疫水平、调控细胞信号通路及传导、抗突变、抑制血管生成和抗多药耐药等多种途径发挥抗肿瘤作用[10]。

  细胞增殖过盛和凋亡抑制被认为是肿瘤发生发展的关键,多种化疗药物均可引起细胞的凋亡[11]。本实验流式细胞仪检测显示,一定浓度的秦艽总苷和龙胆苦苷作用后,凋亡前期细胞率都明显增高,并显示出在同浓度下秦艽总苷处理组抑制率大于龙胆苦苷处理组;发现秦艽总苷作用于smmc-7721细胞后光镜下可观察到凋亡细胞形态学变化,证明秦艽总苷对人肝癌smmc-7721细胞抑制作用的机理与诱导癌细胞凋亡有关。

  本研究观察秦艽总苷在体外对人肝癌smmc-7721细胞增殖的影响,结果显示当秦艽总苷浓度为125 μg/ml时即有抑制作用,随着秦艽总苷浓度的增加和时间的延长其抑制作用更加明显,表明秦艽总苷对smmc-7721细胞生长的作用与药物浓度和时间有密切关系;与同浓度的龙胆苦苷相比较,秦艽总苷抑制率较大,表明秦艽总苷对smmc-7721细胞的抑制作用比单体龙胆苦苷更强。

  现代药理学研究证明,秦艽的主要成分龙胆苦苷(gps)能抑制多种炎症介质包括组胺、5-ht、ltb4、il-1、tnf-α、pg、血栓素血小板活性因子、氧自由基等的释放,对人肝癌细胞具有杀伤效应[12]。然而,氧自由基在细胞增殖、分化、逆转过程中起着重要作用。因此,gps及秦艽总苷抑制肝癌细胞的机理有待进一步深入研究。

【参考文献】
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