EGCG诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡后相关蛋白变化的

摘　要：目的：研究EGCG诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡前后，其蛋白质的差异表达。方法：采用SELDI-TOF-MS技术检测EGCG诱导SMMC-7721细胞凋亡后的相关蛋白变化。结果：EGCG作用前的人肝癌SMMC-7721细胞与作用后的SMMC-7721细胞相比，蛋白分子量高表达的有16个，低表达的也有16个。结论：EGCG作用肝癌细胞前后确实存在差异表达蛋白，这可能有助于EGCG诱导肝癌细胞凋亡机制的研究。

关键词：EGCG;SELDI-TOF-MS;肝癌
 　 原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，根据最新统计，全世界每年新发肝癌患者约六十万，居恶性肿瘤的第五位。目前我国的肝癌患者占全球的55%，发病人数约占全球的半数以上，已经成为严重威胁我国人民健康和生命的一大杀手，其危险性不容小视。表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）是绿茶茶多酚中含量最高，活性最强的单体。大量的体内外实验及流行病学调查证实EGCG具有抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的作用^[1]。研究旨在探讨EGCG诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡后相关蛋白变化，这可能有助于进一步探讨EGCG诱导肝癌细胞凋亡的机制。
1 资料与方法
1.1  一般资料：试剂：EGCE（纯度95%）购自美国sigma公司，用无血清的RPMI-1640培养基配制成浓度为1 mg/ml的工作液，并用0.22 μm的滤头过滤除菌，4℃避光保存；ProteinChip?Biology System（PBSⅡC）型SELDI蛋白质谱仪及其配套的WCX2弱阳离子交换芯片购自美国Ciphergrn Biosystems公司；Ciphergen protein统计软件。
1.2  细胞系：人肝癌细胞SMMC-7721购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
1.3  SELDI-TOF-MS技术检测EGCG作用前后的SMMC-7721细胞裂解液：实验组为EGCG（浓度125 mg/L）作用后的SMMC-7721细胞，对照组为未经EGCG处理的SMMC-7721细胞，然后将细胞培养在终体积为4 ml的培养液中。培养24 h后，倾倒培养液，裂解细胞。裂解后液体用Brandford法检测其蛋白浓度。最后参见文献^[1]方法，进行SELDI-TOF-MS检测。
2 结果
　　实验结果显示EGCG能影响到人肝癌SMMC-7721细胞蛋白的表达。采用SELDI-TOF-MS技术检测EGCG作用前后的人肝癌SMMC-7721细胞裂解液，共捕获到32个有统计学意义的差异蛋白峰（P＜0.05）。其中，EGCG作用前的人肝癌SMMC-7721细胞与作用后的SMMC-7721相比，蛋白分子量高表达的有16个，低表达的也有16个，其相对分子质量见表1。
表1  EGCG作用前的SMMC-7721细胞与作用后的SMMC-7721细胞比较

SMMC-7721细胞低表达的差异蛋白分子量				SMMC-7721细胞高表达的差异蛋白分子量
3049.97	3822.02	4532.58	6631.87	3032.10	3392.57	4091.91	4938.13
3141.68	3930.77	5977.03	6850.42	3107.72	3737.91	4138.25	4964.18
3154.56	4106.17	6066.47	8562.11	3275.71	3910.86	4226.02	5639.09
3202.02	4152.85	6431.82	8690.90	3329.59	4078.52	4283.74	9182.34

3 讨论
　　目前，EGCG的抗肝癌作用已经在动物、细胞和分子水平上进行了大量的研究，这些研究充分表明EGCG对肝癌具有显著的预防作用，然而其作用机制是多方面的，是一个复杂的网络系统，目前尚不完全清楚。大量的研究表明，EGCG诱导细胞凋亡的机制可能与其下调Bcl-2蛋白的表达水平有关。Bcl-2是一种原癌基因，它具有抑制凋亡的作用，其表达水平降低则会导致细胞凋亡。EGCG能抑制Bcl-2蛋白的表达，从而提高Caspaes-3、Caspaes-7和Caspaes-9的水平，最终诱导细胞发生凋亡。还有研究表明，EGCG能够使端粒酶活性下调，诱导肝癌细胞发生凋亡。在一定浓度和时间范围内，EGCG能够下调肝癌细胞端粒酶反转录酶mRNA的表达，由于端粒酶反转录酶mRNA下降与端粒酶活性下降基本一致，因此该结果提示EGCG诱导肝癌细胞凋亡的机制与端粒酶活性的抑制有关。除此之外，还有学者认为EGCG可以通过P53途径、线粒体途径、活性氧途径以及细胞信号传导途径诱导肝癌细胞凋亡。
　　本研究采用SELDI-TOF-MS技术检测EGCG诱导SMMC-7721细胞凋亡前后的细胞裂解液中存在的差异蛋白，结果发现EGCG作用前的SMMC-7721细胞与作用后的SMMC-7721细胞相比，蛋白高表达的有16个，低表达的也有16个。结果说明EGCG对人肝癌SMMC-7721细胞蛋白质的表达有一定的影响，但是捕获的差异蛋白是否包括那些与凋亡机制有关的蛋白，还需做进一步的生物信息学分析和蛋白质谱鉴定。
4 参考文献
[1] 韦  霄,何  敏,黄元姣,等.SELDI技术检测反义寡核苷酸作用前后肝癌细胞培养液的差异蛋白[J].疾病控制杂志,2006,10(3):219.