HCG注射后到授精时间间隔大于42小时对胚胎质量的

　在常规体外受精- 胚胎移植（IVF-ET）中，现在大多中心将授精时间安排在hCG注射后42 h内进行，精卵共孵育后16～18 h后去除卵丘细胞进行原核的观察。本中心在2011年11月前授精时间均安排在hCG注射后43～44 h左右，2012年开始改为hCG注射后39～40 h。为了探明IVF-ET中hCG注射后授精时间延迟是否影响胚胎质量，笔者分析了本中心推迟授精3～4 h前后两个时段授精后的相关临床资料，希望能为临床提供相关的基础数据。
　　1 资料与方法
　　1.1 一般资料 选择2010年1月-2013年4月在本中心行常规体外受精- 胚胎移植（IVF-ET）的患者。纳入标准：年龄≤35岁，长方案。
　　1.2 方法
　　1.2.1 获取卵母细胞 采用黄体中期长方案降调节。前1个月经周期第3天开始妈富隆口服1片/d，17 d后或自然周期B超监测排卵后7 d开始给药短效达菲林1.0 mg/d或0.05 mg/d皮下注射垂体降调节至hCG日。促排卵采用果纳芬（GonalF，瑞士Serono公司），根据B超监测卵泡大小和血清雌二醇（E2）水平适当调整药物剂量，当大卵泡数量占14 mm卵泡30%以上停用促性腺激素，当晚8点肌肉注射hCG（丽珠公司）10 000 IU，36～38 h后在B超引导下取卵。从卵泡液中挑出卵冠丘复合物（OCCC），移入含10%血清代用品（SPS）（IRVINE，USA）的人输卵管液（HTF）（IRVINE，USA）培养液，37 ℃、5% CO2培养箱培养，6 h后行常规体外受精（2012年以后4 h后行常规体外授精）。
　　1.2.2 精子准备 患者丈夫禁欲3～7 d，取卵当天上午9点左右手淫法取精，精液置室温下30 min，液化后采用密度梯度离心方法处理：用精子分离液（美国SAGE IVF，Inc.公司）80% PureCeptionTM 1.5 ml放在15 ml离心管底部，上层缓缓加入1.5 ml 40% PureCeptionTM分离液，最后加1.5～2.0 ml液化好的精液，300 g离心10 min，取精子沉淀，加入Quinn’s HTF 受精培养液2 ml洗涤，200 g离心5 min；取精子沉淀滴入孵育后的Quinn’s HTF受精培养液0.5 ml中，调整精子浓度为20～40×106/ml，放入6 ml圆底试管内，置于5%、CO2、37 ℃培养箱内培养，使精子获能。
　　1.2.3 常规体外受精与胚胎培养 取卵后42～43 h（2012年以后39～40 h），按常规体外受精方法加入优选后的精子，置37 ℃、5%、CO2培养箱；于授精后16～18 h后拆除颗粒细胞，观察受精情况。然后移入含10% SPS（IRVINE，USA）的1026（IRVINE，USA）培养液中；每日上午8：00左右观察。将为2011年前为A组，2012年后为B组，统计并比较两组的受精率、卵裂率、优质胚胎率及可利用胚胎率。
　　1.3 胚胎质量评估 正常受精的标准是见到两个清晰的原核。在受精后第3天，观察卵裂球的形态，并且根据卵裂球形态与大小、有无多核、碎片多少、分布及胞浆情况等进行胚胎评分，分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级胚胎，第三天卵裂球数≥7，碎片≤15%，无不均及多核为优质胚胎。
　　1.4 统计学处理 采用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计分析，计数资料采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　对5493枚卵子进行观察可得，A组hCG注射后授精时间间隔大于42 h授精2105枚卵子，B组hCG注射后授精时间间隔小于40 h授精3388枚卵子，两组的受精率、卵裂率、优胚率、可利用胚胎率比较差异无统计学意义（P>0.05），虽然B组的可利用胚胎率有增高的趋势，但差异无统计学意义，见表1。
　　3 讨论
　　通常在IVF/ICSI治疗周期中，用外源性Gn对患者进行控制性促排卵，使在1个排卵周中使多个卵泡发育，通过获得比较多的卵子来提高每一个周期的妊娠率。在促排卵过程中，一般使用外源性hCG来模拟LH峰促使卵母细胞最后成熟、从而达到诱导排卵的目的。但是也有报道显示延长注射hCG后的取卵时间可以提高卵子的质量。本研究显示推迟授精时间同样没有影响到卵母细胞的受精率、卵裂率、优质胚胎率和可利用胚胎率。
　　卵子的受精是体外受精过程中的关键步骤，是成熟的精子与次级卵母细胞相互作用并结合成为受精卵的过程。在正常人体中，精子与卵子的相互作用以及卵子受精是在性交后20 min内，当一个正常精子到达卵子表面，精子的顶体外膜会发生破裂，释放出顶体酶，可以溶解卵子外周的放射冠，继而和透明带发生顶体反应，这样精子头部就可以穿过放射冠和透明带与卵子的胞质接触，只要有一个精子进入卵母细胞，就可以立即阻断Ca2+流动，并发生皮质反应、透明带反应、卵黄膜反应，使其他精子不能进入，上述过程瞬间即可完成[4]。罗光彬等[4]对家兔进行超促排卵后，在注射HCG后14、16、18 h不同的时间段取卵，然后进行ICSI，观察兔胚胎在体外发育的情况，发现ICSI后的受精率分别为82.2%、75.9%和0[5]。桑椹胚形成率分别为92.9%、70.0%、0，囊胚形成率分别为62.2%、53.3%、0。精子核的去浓缩以及原核形成是胚胎发育所必需的过程，雄原核形成失败与卵母细胞中谷胱甘肽活性低有关。该研究提示卵子成熟后随着卵龄增加谷胱甘肽含量被消耗，可能损害到雄原核的发育，造成受精率降低，注射成熟度偏老的卵子可能会增加损伤纺锤体的机会，损伤到纺锤体的胚胎发育潜能会降低。因此过度延长hCG后的取卵时间可能会影响到获卵率、卵子质量以及形成胚胎后的质量。也有研究显示在体外受精周期中[6]，未成熟的卵子在体外培养成熟后，卵子受精率降低。MⅠ或者GV期的卵子在体外培养4～6 h后并不能使细胞核与胞质的同步化成熟，只有核与胞质同时成熟的卵子才能有好的受精率、卵裂率和胚胎可用率等[7]。eIF4E、EGF类生长因子、PACAP、NuMA等蛋白或因子在卵母细胞的成熟、受精及胚胎发育中都有重要作用[8-11]。本研究显示推迟授精时间并没有影响到卵母细胞成熟、受精率和可利用胚胎率。但资料显示授精时间延后妊娠率却有下降的趋势，因此只有对于取卵时卵子成熟度偏生的完全可以推迟授精，获得更多的可利用胚胎[12]。使患者对自己获得妊娠有更好的预期，使患者的依从性更好。对于成熟度较好的卵母细胞还是推荐在hCG注射后39～40 h进行，以便保证良好的妊娠率。优胚率和可利用胚胎率没有差异可能是因为在延长培养时间后，虽 然将一部分成熟度比较差的卵母细胞胚胎成熟，但致使原来成熟度比较好的卵母细胞老化，对于这部分卵母细胞反而不利，因此并不能将所有情况全部推迟授精，只在获得卵母细胞时对于成熟度大部分都偏生的情况下，延长培养时间，推迟授精。
　　现在普遍认为授精时间是在hCG注射后39～40 h，此时段授精的临床妊娠率是最优的。但是有10%～15%情况仍会出现授精失败及低受精率的情况，现在通常在受精后6 h左右提早拆除卵子周围颗粒细胞，通过观察卵子第二极体的排出情况判断是否受精，如果有不受精或低受精的情况可立即行补救ICSI。因此取卵后授精的时间应该根据卵子的成熟度，适当的提前或延迟授精，在卵子的最佳情况下授精，同时在不影响胚胎质量的前提下早期观察受精情况，最大限度地避免受精失败的发生，从而减轻患者的经济及精神负担。
　　本研究没有将临床妊娠率做对比，因为后期临床方案和移植原则、冷冻原则改动，对妊娠率的影响也比较大，所以只比较了实验室数据，这样可以更客观的说明授精时间对胚胎质量的影响。
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