白细胞介素15及其受体在儿童急性白血病中的表达

【摘要】 目的 探讨il15水平及其受体在儿童急性白血病中的表达及作用。方法 取确诊未治的儿童急性淋巴细胞白血病（all）、儿童急性非淋巴细胞白血病（anll）和非白血病组儿童各20例，20例正常儿童的血清，测定不同组别对象血清il15的水平和不同组别对象的骨髓单个核细胞il15受体三个亚基α、β、γ的表达并进行半定量分析。结果 急性白血病患儿血清il15水平较正常和对照组均出现明显下降；il15受体α、β、γ亚基的表达水平也均较正常组和对照组明显下降，但all与anll组之间和非白血病组与对照组之间差异无统计学意义。结论 急性白血病患儿无论血清il15水平及其骨髓单个核细胞il15受体α、β、γ均出现下降。

【关键词】 急性白血病；白细胞介素15；受体；基因

levels of interleukin15 and its receptor subunit expression in children acute leukemia

ye zhonglv1, chen mingzhen1, chen riling1,huang xiulan1,pang weijun2, chen shuiwen3

ment of pediatrics, affiliated hospital of guangdong medical college,zhanjiang 524001,china;ment of laboratory；al and child health hospital, baoan district, shen zhen

corresponding author：chen mingzhen, email: chenminzhen @tract：objective to investigate the expression of il15 and its receptor in children acute leukemia, contribute to understand their function on acute leukemia. methods every group of acute lymphocytic leukemia(all),acute myeloid leukemia (anll) or nonleukemia group had 20 children who did not receive any treatment. the expression of the interleukin15 receptor alpha,beta,gamma mrna in bone marrow were examined by rtpcr, and make an semiquantitative analysis. the level of il15 in serum of every group by means of s the level of il15 in al（all and anll）group， were significant was assayed in statistics（p<0.05）with healthy children and nonleukemia group .the difference which the il15 level of all compared with anll or the level of healthy children compared with nonleukemia group is neglected in statistics（p>0.05）.the expression of il15r alpha，beta，gamma mrna in al is significantly different than that of healthy and nonleukemia difference which the il15 alpha，beta，gamma of all compared with anll or the level of healthy children compared with nonleukemia group is neglectable in statistics （p>0.05）. conclusion the il15 level of al children is lower than control the expression that of il15rα,β,γ subunit in bone marrow mononuclear cell of al is smaller than those of nonleukemia group.

key words：acute leukemia; interleukin15; receptor；gene

免疫因素在白血病的发生发展中起着重要的作用，尤其是细胞免疫功能的变化，可能与白血病的发生密切相关；白细胞介素15(il15)是一种可溶性的淋巴细胞生长因子。我们既往的研究发现，一定浓度的il15对骨髓增生异常综合征(mds) cd34＋造血细胞有刺激增殖分化和抑制凋亡的效果，其机制可能是与il15上调bcl2、bclxl凋亡抑制基因和caspase3的表达有关[14]。最近，我们通过检测部分白血病患儿及其健康儿童的血清il15水平及其受体表达情况，探讨它们在儿童急性白血病中的表达及作用，现报告如下。

1 资料和方法

1.1 临床资料

所有标本分别来自本院新确诊的病例和健康体检的儿童，均未经过任何细胞因子、激素或化学药物的治疗。分组：急性白血病组患儿40例，年龄4～16岁，其中男26例，女14例；包括急性淋巴细胞白血病(all)患儿20例，男12例、女8例；急性非淋巴细胞白血病(anll)患儿20例，男14例、女6例；诊断标准按张之南主编《血液病诊断及疗效标准》第二版[5]。非白血病组患儿20例，男13例，女7例，年龄在2～13岁，其中缺铁性贫血患儿10例、巨幼细胞性贫血患儿4例、葡萄糖6磷酸脱氢酶 (g6pd) 缺乏症缺乏患儿3例和地中海贫血的患儿3例。正常儿童对照组20例，年龄在4～10岁之间，其中男10例，女10例。

1.2 方法

1.2.1 标本采集

抽取不同组别对象的外周血5ml，用离心机2 000g/min，离心5min，吸取血清转移到另一管，-20℃保存待测。同时抽取骨髓5～10ml，置含肝素的抗凝管中，充分混匀，即时分离单个核细胞，操作过程注意无菌。

1.2.2 il15测定

分离好的血清在常温下解冻20min，从4℃冰箱取出il15 elisa试剂盒在室温下放置20min，平衡至室温。其余的操作按试剂盒说明进行。

1.2.3 pbmc分离、总rna的提取、目的基因rtpcr扩增

（1）引物设计与合成

il15受体α、β、γ亚基基因的mrna从genbank中找出，引物根据primer软件设计，由上海生工生物工程技术服务合成。引物序列为：βactin：(528bp)上游5′ ctacaatgagctgcgtgtgg 3′，下游5′ aaggaaggctggaagagtgc 3′；il15rα：(203bp)上游5′ cacctatg aaa ctcggggaaac 3′，下游 5′ atgggaatgcggag aa cc 3′，il15rβ：(236bp)上游5′ gtgcgatggagggtgatg  3′，下游5′ cattcctgcttctgcttgag  3′，il15rγ: (428bp) 上游5′ cattggaagccgtggttatc 3′,下游5′ ggtgagtatgagacgcaggtg  3′。

（2）rtpcr

按qiagen公司的rtpcr一步法试剂盒说明书操作。其具体步骤为：先加入标本和试剂（冰上进行），然后于pcr仪上进行扩增，参数及条件如下：50℃ 30min,反应条件为94℃，预变性15min，34个循环：94℃变性45 s；50℃～68℃退火30 s；72℃延伸45 s；最后72℃延伸10min，总反应体积为25μl。其中α亚基的退火温度为53℃，β亚基的退火温度为53℃，γ亚基的退火温度为54℃，βactin的退火温度为55℃。α亚基的循环次数为31次，β亚基的循环次数为35次，γ亚基的循环次数为35次，βactin的循环次数为31次。

1.2.4 电泳和图像分析

取目的基因产物和内参产物混匀，于2%琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪观察结果，并拍照图片，图片经扫描仪扫描后，用sigmascan 5.0图像分析软件进行光密度积分值分析，分别计算出检测基因与βactin (内参)的光密度值之比，作为其相对含量值。

1.3 统计学方法

计量资料用±s表示，使用spss11.５统计软件进行统计分析，多个样本均数的比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。

2 结果

2.1 白细胞介素15的水平

不同组别血清中白细胞介素15的水平检测，急性淋巴细胞白血病组的il15浓度为（34.37±2.8）pg/ml，急性非淋巴细胞白血病组的浓度为（29.61±3.2）pg/ml，正常对照组的浓度为（122.23±4.2）pg/ml，非白血病组的浓度为（117.54±3.9）pg/ml；其中all、anll组il15的浓度分别和正常对照组的浓度进行比较，p均<0.05，差异有统计学意义。all、anll组il15的浓度分别和非白血病组的浓度进行比较，p均<0.05，差异有统计学意义。all和anll组比较、正常对照组和非白血病组比较，p均>0.05，差异无统计学意义，见表1。表1 不同组别外周血清中il15浓度

2.2 不同组别的骨髓单个核细胞的il15受体α亚基基因表达

il15受体α亚基条带在非白血病组最清晰，all组、anll组、非白血病组的表达率分别是75％、75％、100％，α亚基表达的病例中灰度扫描结果比值分别为0.4618±0.1460、0.4952±0.1271、0.8964±0.2130。all组、anll组灰度扫描结果的比值分别和非白血病组的比值进行比较，p均<0.05，有显著性差异。而且all组灰度扫描结果的比值与anll组的比值进行比较，p>0.05，差异无统计学意义，见图1。

2.3 不同组别的骨髓单个核细胞的il15受体β亚基基因表达

il15受体β亚基条带在非白血病组最清晰，all组、anll组、非白血病组的表达率分别是80％、85％、100％，β亚基表达的病例中灰度扫描结果比值分别为0.5391±0.1740、0.5514±0.1961、0.8846±0.1310。all组、anll组的灰度扫描结果比值分别和非白血病组的比值进行比较，p均<0 .05，差异有统计学意义。而且all组灰度扫描结果的比值与anll组的比值进行比较，p>0.05，差异无统计学意义，见图2。

2.4 不同组别的骨髓单个核细胞的il15受体γ亚基基因表达

il15受体γ亚基条带在非白血病组最清晰，all组、anll组、非白血病组的表达率分别是80％、80％、100％，γ亚基表达的病例中灰度扫描结果比值分别为0.5104±0.1245、0.4997±0.1072、0.9062±0.2013。用all组、anll组灰度扫描结果的比值分别和非白血病组的比值进行比较，p均<0.05，有显著性差异。而且用all组灰度扫描结果的比值与anll组的比值进行比较，p>0.05，差异无统计学意义，见图3。

3 讨论

通过检测il15水平，结果all组、anll组血清il15的水平均较非白血病组和正常对照组低，但all和anll的血清il15水平差异无统计学意义，说明il15在急性白血病患儿中的表达水平要比正常儿童的低。由于il15具有一定的免疫介导作用，其水平下降，可能是导致急性白血病患儿免疫功能低下的原因之一，郭承吉等 [6]发现il2也存在类似现象。由于il15和il2有着广泛的同源性；是否急性白血病血清il15的水平也与病情及预后相关，而通过调节或刺激体内的细胞因子水平，是否可以达到一定的抗肿瘤作用[7]？因此，对白血病患儿的il15水平进行动态观察，可能有助于观察al的病情发展，判断预后及预测复发。

在atl疾病，人类t细胞白血病病毒ⅰ（htlvⅰ）感染的细胞其il15rαmrna表达显著升高，而且htlvⅰtax蛋白的表达可进一步使il15rαmrna水平升高，表明il15rα在atl细胞增殖中有一定的作用[8]。也有发现il15r高表达的白血病患儿其预后较好，生存期长，目前机制未明[9]；本课题用rtpcr方法从分子水平上检测骨髓中单个核细胞il15r亚基mrna的表达，检测显示：all组、anll组、非白血病组il15受体α亚基mrna的表达率分别是75％、75％、100％；β亚基mrna的表达率分别是80％、85％、100%；γ亚基mrna的表达率分别是80％、80％、100%，其中α亚基在bmmc的表达率未见有文献报道；β亚基表达率较文献[10]报道偏高，与文献[11]结果相似；而γ亚基的表达率和文献[11]报道基本一致。而且在all组、anll组中il15r三个亚基mrna的表达水平均比非白血病组低，说明急性白血病il15 受体三个亚基无论是表达率还是表达水平均要低于非白血病组。

在白血病中,除少数类型白血病细胞外,人们检测到大多数白血病细胞有fas 的高表达[12] , fas/fasl 系统作为诱导细胞凋亡的一条重要途径,也参与了白血病的发病过程。并且发现fas的表达与白血病的病情进展、治疗效果及预后密切相关。已有研究表明il15不仅能阻止自发的凋亡而且能够阻止fas引起的死亡信号介导的广泛凋亡[13]；而且bcl2 家族通过调节某些细胞中的fas 介导凋亡,尤其是bcl2 基因的上调,能对一些肿瘤提供fas 抗性[14] ,对白血病细胞的作用则是阻止分化细胞凋亡。因此，il15r在急性白血病的发生发展中是否起到一定的作用，从而在一定程度上导致al发生的问题值得进一步探讨。

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