外源性p21waf1基因转染对人胃癌细胞系的识别分析

　p21waf1为野生型p53激活片段（wild-type p53 activated fragment 1，WAF1），它为单拷贝基因，是一种非常重要的抑癌基因，也是目前研究热点。因此，本研究将外源性p21waf1基因转染到人胃癌细胞系BGC-823中，使其稳定表达后，来研究其对人胃癌细胞增殖的影响。
　　1　材料与方法
　　1.1　实验材料　pIRES-p21waf1真核表达载体、人胃癌细胞系BGC-823（由青岛大学医学院附属医院中心实验室构建并惠赠），基因转染试剂盒（QIAGEN公司），Trizol试剂、DMEM-高糖培养基（Invitrogen公司），RT-PCR试剂盒（Takara公司），p21waf1及3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）引物及各自Taqman探针（由青岛大学医学院附属医院中心实验室提供），鼠抗人p21waf1单克隆抗体（Santa Cruz公司），兔抗鼠二抗、四甲基偶氮唑蓝（MTT）（QIAGEN公司）。
　　1.2　细胞培养方法　人胃癌细胞系BGC-823培养条件为含10％胎牛血清的DMEM-高糖完全培养液，37 ℃、5％CO2饱和湿度孵箱中孵育。倒置相差显微镜观察细胞形态，取对数生长期细胞进行相关实验。
　　1.3　基因转染条件和方法　参照QIAGEN转染试剂盒说明书进行。采用24孔板转染细胞，分三个组，分别为pIRES-p21waf1转染组、pIRES-neo空载体组、未转染组。
　　1.4　p21waf1 mRNA表达的检测　依次收集转染后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d的各组细胞，按照Trizol试剂盒说明提取总RNA。p21waf1基因引物设计：上游：5’-GGACAGCAGAGCACC
　　1.5　p21waf1蛋白表达的检测　依次收集转染后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d的各组细胞，提取细胞总蛋白，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，进行一抗（鼠抗人p21单克隆抗体）、二抗（辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗）孵育和显色，曝光并照相。使用HPIAS-1000型全自动图像分析仪分析蛋白条带灰度值。
　　1.6　细胞增殖能力的检测　各组均取对数生长期的细胞，采用经典的MTT法检测后，绘制细胞生长曲线，分析各组细胞的增殖能力。
　　1.7　细胞周期分布的检测　依次收集转染后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d的各组细胞，各约1×106个细胞，加入终浓度70％冷乙醇，4 ℃固定24 h，PBS洗涤离心三遍，加入Rnase酶（2 mg/ml）于37 ℃水浴30 min，再加碘化丙啶（25 mg/ml）染色，4 ℃避光20 min，经尼龙网滤过后，上流式细胞仪检测各组细胞周期分布情况。
　　1.8　统计学处理　采用SPSS 13.0统计软件包进行处理，计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用t 检验，计数资料采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
　　2　结果
　　2.3　p21waf1基因转染对胃癌细胞BGC-823细胞增殖的影响　MTT证明，p21 waf1转染组胃癌细胞系BGC-823的增殖速度明显要低于空载体组、未转染组，p21waf1转染组在生长5 d后出现增殖速度减慢，而空载体组及未转染组则表现出持续增殖的态势，差异有统计学意义（P<0.01）。而空载体组及未转染组两组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。各组p21waf1蛋白表达见图3。
　　3　讨论
　　据众多研究表明，细胞周期失去控制是肿瘤细胞恶性增殖重要原因之一。
本研究将外源性p21waf1基因转染人胃癌细胞系BGC-823中后，p21waf1转染细胞组，p21waf1mRNA和p21waf1蛋白均高表达；p21waf1转染组BGC-823细胞生长速度低于空载体组和未转染组；流式细胞仪观察到p21waf1蛋白高表达使BGC-823细胞发生G1/S阻滞，G1期细胞数目明显要多于空载体组和未转染组，而S期细胞数则明显要低于空载体组和未转染组，并出现凋亡峰。笔者认为，外源性p21waf1基因转染且稳定表达后，可能通过p21waf1-cyclins-CDKs途径，起到对CDKs和PCNA的活性的双重抑制，进而使癌细胞DNA合成及细胞周期演进受阻，最终导致癌细胞增殖活性明显降低，大量停滞于G1期。根据本文结果，笔者认为，外源性p21waf1基因转染可以抑制人胃癌细胞系BGC-823细胞增殖和促进细胞凋亡，将来可能为研究胃癌的治疗方法提供一条新的思路。
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