鼻咽癌组织表达VCAM1与局部淋巴细胞浸润的关系

作者：苏炳泽，罗志飞，王东明，何金龙，李群

【摘要】 目的：观察鼻咽癌组织表达血管粘附分子-1（vcam1）与局部浸润淋巴细胞的关系。方法：收集51例鼻咽癌和22例慢性鼻咽炎石蜡标本和临床资料，观察癌巢间淋巴细胞浸润程度，计数癌巢内淋巴细胞数量；用vcam1、cd3、cd4、cd8单克隆抗体进行免疫组化染色，并判断鼻咽癌表达vcam1程度，计数cd3+和cd4+、cd8+t细胞。结果：（1）癌细胞表达vcam1的鼻咽癌病例达92.16%。（2）鼻咽癌细胞表达vcam1与淋巴结转移与否、分化程度和临床分期均无关(p>0.05)。（3）鼻咽癌细胞表达vcam1与巢间淋巴细胞浸润程度、巢内淋巴细胞数量、cd4+、cd8+t细胞数量均无关(p>0.05)。（4）鼻咽癌细胞轻度表达vcam1时组织中cd3+t淋巴细胞明显增多（p=0.009），但不显示强度依赖性作用。结论：（1）vcam1在鼻咽癌细胞表达率很高，其表达强度与转移和临床分期无关。（2）鼻咽癌细胞表达vcam1与正常细胞表达vcam1的生理作用有所不同，不显示明确地吸引淋巴细胞的作用。

【关键词】 鼻咽癌；血管粘附分子1;淋巴细胞

［abstract］ objective: to observe the relation between expression of vascular cell adhesin molecule1(vcam1) on nasopharyngeal carcinoma and infiltrating lymphocytes. methods: the lymphocytes infiltrating in stroma and in carcinoma nest were observed on paraffin slides coming from 51 cases with nasopharyngeal carcinoma (npc). meanwhile the expression of vcam1 and the number of t lymphocytes and cd3+ cd4+ and cd8+ subset of t lymphocytes were counted on immunochemical staining slides. results: (1) 92.16% npc cases (47/51) expressed the vcam1 at different degrees. (2) no relation existed between expression of vcam1 and either node metastasis, tumor differentiation and stage, or infiltrating lymphocytes, cd4+ and cd8+ t cell subsets. （3）weak expression of vcam1 by nasopharyngeal carcinoma cell correlated with increased number of cd3+ t cell（p=0.009）, but there was no intensity dependent relation between two events. conclusion: (1) vcam1 highly expressed on npc but independently of the metastasis, tumor differentiation and stages. (2) the vcam1expressed by npc cells did not show definite effect of attracting the lymphocytes as that by normal cells did.

［key words］ nasopharyngeal carcinoma; vascular cell adhesin molecule1(vcam1); lymphocyte

鼻咽癌患者血清中血管黏附分子1（vascular cell adhesin molecule 1, vcam1）升高和肿瘤组织高表达vcam1早已见诸报道［14］，但对其在鼻咽癌中表达的意义研究不多。m1 是一种诱导表达型细胞因子，属于免疫球蛋白家族成员，主要表达于血管内皮细胞［5］，它与血液中表达其配体非常迟抗原4（very late antigen 4,vla4）的单个核细胞结合，介导它们穿出血管,故vcam1在炎症反应中扮演重要角色。鼻咽癌富于淋巴间质，一度被称为淋巴上皮癌,鼻咽癌细胞表达vcam1与其淋巴间质的形成有无关系值得研究。本文观察了vcam1在鼻咽癌组织中表达的规律及其与间质中淋巴细胞的关系,现报道如下。

1 材料和方法

1.1 标本来源

73例石蜡标本收集2003～2006年间在海南医学院附属医院就诊并经病理组织学活检的门诊及住院病人，其中鼻咽慢性炎症患者22例，男性16例，女性6例，平均年龄（39.50±13.89）岁。鼻咽癌患者51例，男性36例，女性15例，平均年龄（47.17±14.74）岁，35例伴有淋巴结转移，16例无转移，临床分期，ⅰ期12例，ⅱ期14例，ⅲ期16例，ⅳ期9例。全部鼻咽癌标本均经病理组织学常规he诊断，未分化癌28例，低分化鳞癌23例。

1.2 免疫组化检测

采用链霉卵白素辣根过氧化物酶（sp）法染色。兔抗人vcam1多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，兔抗人单克隆cd3、cd4、cd8抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。t细胞亚群指标用正常淋巴组织作阳性对照，vcam1用博士德生物工程有限公司提供的阳性对照片作阳性对照，各指标均以磷酸缓冲液代替一抗作阴性对照。vcam1、cd3、cd4及cd8工作液浓度分别为1∶100、1∶200、1∶200和1∶100。

1.3 结果判断

1.3.1 淋巴细胞浸润情况的观察［6］ 分别观察癌巢间淋巴细胞和癌巢内淋巴细胞，在组织切片上对巢间淋巴细胞分别随机观察4个视野，按淋巴细胞浸润的密度分为5个级别：极少为0级，较少为1级，中等量为2级，较丰富为3级，丰富为4级。取4个视野的平均值。巢内淋巴细胞的计数方法为：在高倍镜下随机观察4个癌巢，在10×10网格计数尺中计数癌巢内的淋巴细胞数量，取其平均值。

1.3.2 组织中免疫组化指标vcam1、cd3、cd4、cd8的结果判断 （1）vcam1阳性显色为棕黄色至棕褐色颗粒或粉尘状,主要位于胞膜,部分见于胞浆。在高倍镜（10×40）下随机观察不重复的10个视野，每个视野下按阳性细胞占肿瘤细胞的比例以及染色的深浅综合进行半定量分级评分。阳性细胞≤5%计为0分，6%～25%计1分,26%～50%计2分,51%～75%计3分，>75%计4分；同时按染色强度由浅至深分为5个等级，无细胞着色为0级,有细胞着色时按着色深浅分别计为0、1、2、3和4分；将阳性细胞积分与相应的染色强度积分相乘即得此视野下vcam1的综合积分，最低0分，最高16分，10 个视野的平均值即为此组织标本中vcam1的表达积分；将积分转换为5个等级：0分为0级（阴性），0.01～4分为1级，4.01～8分为2级，8.01～12分为3级，12.01～16分为4级。（2）cd3、cd4和cd8阳性细胞分别计数，阳性显色亦是棕黄色至棕褐色粉尘状，定位于细胞膜，在高倍镜（10×40）下随机观察不重复的10个视野，计数每个视野下阳性细胞个数，取其平均值，即为本组织标本的cd3+ t细胞、cd4+t细胞和cd8+ t细胞的计数结果。

1.4 统计学处理

所得数据采用spss 16.0统计软件进行分析。检验方法应用非参数检验（mannwhitney test、kruskalwallis test和chisquare test）和秩相关（spearman's rho），检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 鼻咽癌组织中vcam1的表达及其与临床资料的关系

51例鼻咽癌组织中vcam1表达阳性率为92.16%（47/51），阳性定位于鼻咽癌细胞膜和（或）胞浆（图1）。vcam1的表达强度在有无淋巴结转移、低或未分化鼻咽癌之间差异无统计学意义（p>0.05）（表1）。4例未表达vcam1的病例和71%（5/7）的1级表达病例都集中在临床i期和ⅱ期，但vcam1的平均表达强度在临床各分期之间差异无统计学意义（h=1.512,p=0.673）（表2）。 表1 鼻咽癌组织中vcam1表达与淋巴结转移 和分化程度的关系注：* mannwhitney test。苏炳泽等.鼻咽癌组织表达vcam1与局部淋巴细胞浸润的关系 表2 鼻咽癌组织中vcam1表达与临床分期的关系*(例)注：* kruskalwallis test。

2.2 鼻咽癌组织中淋巴细胞浸润及t淋巴细胞和cd4+、cd8+亚群的分布情况

51例鼻咽癌组织间质和癌巢内均可见淋巴细胞（图2）。巢间淋巴细胞浸润程度和巢内淋巴细胞数量在不同分化程度、有无淋巴结转移和不同临床分期之间差异均无统计学意义(p>0.05)（表3）。

鼻咽癌患者cd3+、cd4+和cd8+t细胞均低于慢性鼻咽炎患者，但仅有cd4+t细胞数量在两组间差异有统计学意义（p=0.000）。在临床进展中，ⅰ、ⅱ期cd4+t细胞数量多于ⅲ、ⅳ期，但差异无统计学意义(p>0.05)；cd3+t细胞数量在不同临床分期中差异有统计学意义（p=0.021），有淋巴结转移的ⅱ期明显低于无淋巴结转移的ⅰ期（p=0.001），有淋巴结转移患者的cd3+t细胞也明显低于无转移者（p=0.027）。cd8+t细胞在各期差异无统计学意义(p>0.05)（表3）。表3 鼻咽癌组织中浸润淋巴细胞与临床病理特征的关系 注：* z=mannwhitney test，h=kruskalwallis test；**为等级资料。

2.3 vcam1 与巢内、巢间淋巴细胞以及t细胞亚群的关系

将鼻咽癌病例以癌组织表达vcam1的不同程度分组，各组间巢内、巢间淋巴细胞浸润程度以及cd4+、cd8+亚群计数无明显变化（表4），但cd3+t细胞在vcam1表达强度为1级时数量很多，与其他等级相比，差异有统计学意义（p=0.009）。等级间的两两比较发现，1级与0、2、3级之间差异有统计学意义（p均<0.05）。显示同样趋势的还有cd8+，但差异无统计学意义（p=0.495）。表4 vcam1表达强度与t细胞亚群以及巢内、巢间淋巴细胞的关系*

　　3 讨论

20世纪90年代以来，肿瘤与vcam1的关系受到人们关注。文献报道在多种肿瘤中vcam1水平升高［1，7］，鼻咽癌患者血清中vcam1升高［1，2］，组织中癌细胞也高表达vcam1［3，4］。本实验结果与文献报道一致。liu等［1］比较3种头颈部肿瘤血清黏附因子水平，发现仅有鼻咽癌组织细胞间粘附分子1（icam1）、vcam1和eselectin 3种黏附因子都升高，喉癌只有2种因子升高，口腔癌仅有一种因子升高，可见上调黏附因子表达的因素在鼻咽癌是比较强烈的，这可能与鼻咽组织的特点有关。bourges等［8］发现鼻咽黏膜上皮和固有膜表达vcam1、粘膜血管地址素（mucosal vascular addressin,mad)和黏膜地址素细胞黏附分子1(mucosal addressin cell adhesion molecule1)，而浸润其中的t细胞和siga阳性的b细胞都强表达vla4。kupczyk等［9］发现对阿司匹林敏感患者的鼻息肉中vcam1、vla4都升高。vcam1等黏附分子在正常鼻咽组织和炎症时的表达可能是出于吸引淋巴细胞到局部聚集的需要。

本组资料显示，虽然所有不表达vcam1和大多数弱表达的病例都集中在鼻咽癌ⅰ、ⅱ期，但因各期3、4级强表达病例所占百分比接近，而未显示随分期进展vcam1表达增强的特点。此外，也未发现vcam1表达与淋巴结转移、癌细胞分化程度有关。

对于肿瘤中vcam11升高的意义，各家看法不一。有学者认为vcam1升高提示肿瘤预后不良［10］，也有学者认为vcam1升高现象与肿瘤进展和预后无关［1，7, 11］。

我国95%以上的鼻咽癌是非角化性鼻咽癌，非角化性鼻咽癌是一个富于淋巴间质的肿瘤，早已有报道鼻咽癌间质中存在的淋巴细胞以t淋巴细胞为主［12］，肿瘤免疫主要是由t细胞主导的细胞免疫。而vcam1有吸引淋巴细胞聚集的作用，还能作为共刺激分子激活t细胞［5］。为了解鼻咽癌细胞表达vcam1是否具有类似血管内皮细胞表达vcam1的生物学作用，本实验观察了鼻咽癌细胞表达vcam1与鼻咽癌组织中浸润淋巴细胞密度和t细胞亚群的关系，结果发现癌巢间和癌巢内浸润淋巴细胞密度与癌细胞表达vcam1程度无关。但cd3+的t细胞在vcam1轻度表达时（1级）数量明显多于vcam1不表达和较强、强表达时，这种增多显然与cd8+t细胞数量变化有关，虽然cd8+t细胞的变化未显示统计学差异。

人体肿瘤细胞能高表达vcam1的不多。最近有研究认为肿瘤细胞高表达vcam1是一种肿瘤逃逸免疫机制［13］。体外培养实验证明，将高表达vcam1的肿瘤细胞注射进小鼠体内，成瘤比不表达vcam1的同类肿瘤细胞快且大，肿瘤细胞凋亡减少，肿瘤中cd8+t细胞数量也减少，对肿瘤免疫治疗不敏感。应用rna沉默技术消除vcam1表达，则肿瘤细胞在很大程度上恢复对免疫治疗的敏感性，在小鼠体内成瘤明显减慢，瘤体也小。体外培养实验还发现，高表达vcam1的肿瘤细胞通过vcam1位于胞外的第1和第4免疫球蛋白2个结合位点与表达vla4的cd8+t细胞结合促进其移动。作者认为肿瘤细胞促使cd8+t细胞加快移动远离肿瘤，导致肿瘤局部免疫能力降低。据此推测，本实验vcam1轻度表达时t淋巴细胞增多，体现vcam1对表达vla4的t细胞的吸引作用；表达增强时，cd3+、cd8+t细胞又大幅回落，可能是过表达的vcam1促进了t细胞的远离运动，该现象值得扩大样本量继续观察并深入探讨其机制。

【参考文献】
1 liu cm, sheen ts, ko jy, et al. circulating intercellular adhesion molecule 1 (icam1), eselectin and vascular cell adhesion molecule 1 (vcam1) in head and neck cancer ［j］. br j cancer,1999，79(2):360362.

2 王东明，罗志飞，陈明净，等. 鼻咽癌患者血清svcam1表达及其与il1、il4等细胞因子的关系［j］. 海南医学院学报，2007，13（1）：11.

3 ruco lp, stoppacciaro a, uccini s, et al. expression of intercellular adhesion molecule1 and vascular cell adhesion molecule1 in undifferentiated nasopharyngeal carcinoma (lymphoepithelioma) and in malignant epithelial tumors［j］. hum pathol, 1994,25(9):924.

4 李群， 宗永生，梁英杰，等. vcam在非角化性鼻咽癌中表达的初步探讨［j］. 癌症,1998,17（4）：308.

5 何龙. vcam1的研究进展［j］. 国外医学(免疫学分册),1997,20（3）：117.

6 李锦添，宗永生. 鼻咽癌的病理改变与血清中eb病毒vcaiga抗体滴度的关系［j］.中华病理学杂志,1986，15（2）：122.

7 ho jw, poon rt, tong cs, et al. clinical significance of serum vascular cell adhesion molecule1 levels in patients with hepatocellular carcinoma ［j］. world j gastroenterol,2004,10(14):20148.

8 bourges d, chevaleyre c, wang c, et al. differential expression of adhesion molecules and chemokines between nasal and small intestinal mucosae: implications for t and siga(+) blymphocyte recruitment［j］. immunology, 2007,106(1):16.

9 kupczyk m, kupry i, danilewicz m, et al. adhesion molecules and their ligands in nasal polyps of spirinhypersensitive patients ［j］. ann allergy asthma immunol,2006, 96(1):10511.

10 o’hanlon dm, fitzsimons h, lynch j, et al. soluble adhesion molecules (eselectin, icam1 and vcam1) in breast carcinoma ［j］. eur j cancer,2002,38(17):22527.

11 perabo f, sharma s, gierer r, et al. circulating intercellular adhesion molecule1 (icam1), vascular cell adhesion molecule1 (vcam1) and eselectin in urological malignancies［j］. indian j cancer,2001,38(1):17.

12 zong ys, lin h, choy dt, et al. nasopharyngeal carcinoma and lymphoinfiltration ［j］. oncology,1991,48(4):2906.

13 lin ky, lu d, hung cf, et al. ectopic expression of vascular cell adhesion molecule1 as a new mechanism for tumor immune evasion［j］. cancer res,2007,67(4):183241.