上皮细胞激酶—2与层黏连蛋白5—γ—2在食管鳞癌

　我国是食管癌的高发区，研究食管癌的发病机制、提高早期诊断率、寻找新的治疗途径是食管癌防治的关键[1]。食管癌是生长迅速的肿瘤，因此食管癌组织内常常存在着乏氧微环境。缺氧状态可以刺激肿瘤细胞合成和分泌大量促血管生成因子如血管内皮生长因子（VEGF）等，促进肿瘤血管的生成，促进恶性肿瘤生长、浸润和转移。血管生成拟态（vasculogenic mimicry，VM）是近年来发现的一种存在于高侵袭性肿瘤的血液供应方式，是由肿瘤细胞通过自身变形和基质重塑产生血管样通道，并与宿主血管相连，使肿瘤获得足够血供的一种血管化途径。VM的存在对肿瘤浸润、转移有着巨大影响，与恶性肿瘤的预后密切相关[2-3]。层黏连蛋白（laminin，LN）是一种有多种生物学功能细胞外基质的糖蛋白，它们在基底膜的构建及细胞粘附、生长、迁移和分化中扮演着至关重要的角色[4]。有研究显示，层黏连蛋白的功能角色（5γ2链）在VM形成中发挥着重要功能[5]。细胞过表达血管生成2（-2）能使LN5-γ-2表达上调[6]。EphA2 是Eph亚家族成员中被发现的具有酪氨酸酶活性的第一个基因编码产物，其功能涉及调节胚胎发育、细胞增殖和迁移及血管生成。本研究组前期研究证实EphA2在食管鳞癌中是高表达的[7]，用EphA2 shRNA质粒稳定转染人食管鳞癌细胞株Eca-109和TE13细胞后，采用Matrigel体外三维培养，发现在有氧和缺氧条件下，抑制EphA2表达均可使肿瘤细胞管腔形成数量明显减少[8]。本研究从肿瘤血管生成拟态的关键因子LN入手，探讨EphA2与LN之间的关系，初步探讨肿瘤血管生成拟态的形成环节。
1?材料与方法
　　1.1?细胞株及细胞培养
　　人低分化食管鳞癌细胞株TE13购自上海细胞所，本研究组已成功构建EphA2shRNA质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP shRNA，稳定转染TE13细胞，获得TE13 EphA2/Neo细胞株和TE13 EphA2/shRNA细胞株。所有细胞培养于含10%胎牛血清RPMI-1640培养液中，在37℃，5%CO2及饱和湿度环境的培养箱中培养。
　　1.2?主要试剂
　　RPMI-1640培养基购自Hyclone公司，鼠抗人EphA2购自R&D公司，兔抗人laminin 5-γ-2抗体购自SantaCruz公司。ProteinA琼脂糖珠购自Millipore公司。M-MLV逆转录试剂购自Fermentas公司。
　　1.3?逆转录PCR（RT-PCR）检测
　　TE13细胞、TE13EphA2/Neo细胞和TE13 EphA2/shRNA细胞转染48 h后倒掉6孔板中的培液，每空加入1 mL的TRIZOL试剂，按照TRIZOL试剂的说明书抽提RNA。之后取1μg的RNA，按照Takara逆转录试剂盒的要求将总RNA逆转录成cDNA，逆转录条件为：37℃ 15 min，85℃ 15 s，4℃ +∞。引物设计由上海杰瑞生物工程有限公司完成，LN的引物为：上游引物5‘-TGAAGCGTAACCAGCCGACGC-3’，下游引物5‘-CACAAACAGCACGTCCGGCTCT-3’，以GAPDH为内参，其上游引物为5‘-GGGCTCTCTGCTCCTCCCTGTT-3’，下游引物为5‘-GCCGTTGAACTTGCCGTGG-GTAG-3’。Q-PCR的条件为95℃ 5 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40 cycles，其中以evergreen为荧光染料。
　　1.4?细胞免疫组化
　　TE13细胞、TE13EphA2/Neo细胞和TE13 EphA2/shRNA细胞培养24 h，细胞以冰甲醇固定，兔抗人laminin 5-γ-2抗体工作浓度1∶200，以PBS代替一抗作阴性对照。DAB染色，光镜下观察细胞胞浆或胞核内出现棕褐色颗粒为阳性。
　　1.5?Western Blot检测
　　TE13细胞、TE13EphA2/Neo细胞和TE13 EphA2/shRNA细胞提取总蛋白，40μg蛋白上样用5%浓缩胶、10%～15%分离胶进行SDS-PAGE电泳，电转蛋白至PVDF膜，5%脱脂奶粉37℃封闭1 h，分别与相应一抗4 ℃孵育过夜。PBST洗膜3次后与相应辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃孵育2 h。ECL孵育3 min，暗室曝光并洗片。
　　1.6?统计学处理
　　所有数据采用统计学软件SSPS11.0处理，均以（）表示，以P<0.05为差异有统计学意义。
　　2?结果
　　2.1?RT-QPCR检测laminin5-γ-2 mRNA的表达
　　TE13 EphA2/shRNA细胞中的EphA2（灰度值0.12±0.01）和laminin5-γ-2mRNA（灰度值0.14±0.01）的表达水平明显低于在TE13细胞（灰度值1，1）和TE13 EphA2/Neo细胞（灰度值0.99±0.01，0.98±0.01）中的表达，差异有统计学意义（P<0.05）。TE13细胞和TE13 EphA2/Neo细胞中EphA2和laminin5-γ-2mRNA的表达水平，差异无统计学意义（P>0.05）。见图1。
　　2.2?EphA2对laminin5-γ-2在TE13细胞中蛋白表达的影响
　　EphA2和laminin5-γ-2在TE13中均存在高表达。细胞免疫组化表明，laminin5-γ-2在TE13细胞和TE13 EphA2/Neo细胞胞浆内呈阳性表达，而laminin5-γ-2在TE13 EphA2/shRNA细胞中的表达明显低于在TE13细胞和TE13 EphA2/Neo细胞中的表达。见图2。Western Blot检测表明，在TE13 EphA2/shRNA细胞中，EphA2（灰度值0.10±0.01）和laminin5-γ-2（灰度值0.01±0.00）的蛋白表达水平明显低于在TE13细胞（灰度值1，1）和TE13 EphA2/Neo细胞（灰度值0.98±0.01，0.99±0.01）中的表达，差异有统计学意义（P<0.05）。TE13细胞和TE13 EphA2/Neo细胞中EphA2和laminin5-γ-2的蛋白表达水平，差异无统计学意义（P>0.05）。见图3。
　　3?讨论
　　EphA2是Eph亚家族成员中被发现的具有酪氨酸酶活性的第一个基因编码产物，是1990年Lindberg等[6]从人角化上皮细胞cDNA文库中筛选得到的。EphA2广泛表达于人类上皮来源的细胞，包括表皮、肺脏、肠道上皮细胞和卵巢组织等，其功能涉及调节胚胎发育、细胞增殖和迁移及血管生成。近年来研究表明，EphA2 在许多肿瘤组织中呈高表达，包括乳腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌和胃癌等[9-13]。同时临床研究还发现EphA2的高表达与临床分期、淋巴结转移及预后密切相关[9-10]。本研究组前期研究也证实EphA2在食管鳞癌中高表达[7]，而且用EphA2 miRNA干扰质粒转染人食管鳞癌细胞株Eca-109和TE13细胞后，采用Matrigel体外三维培养，发现在有氧和乏氧条件下，抑制EphA2表达均可使肿瘤细胞管腔形成数量明显减少[8]，提示EphA2与食管鳞癌的VM生成密切相关。
　　层黏连蛋白是一种有多种生物学功能细胞外基质的糖蛋白，它们在基底膜的构建及细胞粘附、生长、迁移和分化中扮演着至关重 要的角色[4]。LN-5是1987年Verrando等发现的，是一个由α3、β3、γ2三条多肽链经二硫键结合的糖蛋白分子。层黏连蛋白-5的功能角色（γ2链）在VM形成中发挥着重要功能[14]。
血管生成拟态是近十年来肿瘤研究领域提出的新概念。与经典的由内皮细胞构成的血管不同，它是由细胞外基质和肿瘤细胞包绕着红细胞而构成的血管状结构。目前研究表明EphA2、LN5及VE-cadherin与血管生成拟态密切相关，笔者在前期研究中通过沉默VE-cadherin的表达，发现TE13细胞形成VM的能力下降，同时EphA2和laminin5-γ-2的蛋白表达水平也出现下降，可见VE-cadherin通过调节EphA2和laminin5-γ-2表达水平来影响TE13细胞形成VM的能力的[7]。在本研究中笔者发现在TE13 EphA2/shRNA细胞中，laminin5-γ-2在mRNA水平及蛋白水平上表达明显较TE13细胞和TE13 EphA2/Neo细胞下降，这提示laminin5-γ-2可能接受EphA2的调控，是EphA2的下游基因。EphA2可能是通过调控laminin5-γ-2来对食管鳞癌肿瘤血管生成拟态进行调节的。
　　综上所述笔者发现，laminin5-γ-2可能接受EphA2的调控，是EphA2的下游基因。EphA2可能通过调控laminin5-γ-2来对食管鳞癌肿瘤血管生成拟态进行调节。上述结果让笔者对血管生成拟态的发生机制有了进一步的认识，为生物治疗食管癌提供了一定的理论基础。
　　[参考文献]
　　.Cancer Res，2002，62（3）：860-866.
　　[2] Folberg R，Hendrix MJ，Maniostis ogenic mimicry and tumor angiogenesis[J].Am J Pathol，2000，156（2）：361-381.
　　. Oncol Rep，2006，15（1）：15-20.
　　[4] Colognato H，Yurchenco and funcition：the laminin family of beterotrimers[J].Dev Dyn，2000，218（2）：213-234.
　　[5] Maniotis AJ，Folberg R，Hess A，et ar channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro：vasculogenic mimicry[J].Am J Pathol，1999，155（3）：739-752.
　　[6] Indberg R A，Hunter cloning and characterization of Eck，an epithelial cell receptor protein 2 tyrosine kinase in the eph/Eck family of protein kinases[J].Mol Cell Biol，1990，10（12）：6316-6324.
　　[7] 金海林，施瑞华，朱宏，等.缺氧诱导因子-1α与EphA2在食管鳞状细胞癌中的表达及其相关性研究[J].中华消化杂志，2010，30（3）：184-188.
　　[8] 王频，王璐，丁宗励，等.EphA2在缺氧条件下的表达及其对食管癌细胞体外三维培养的影响[J].世界华人消化杂志，2011，19（10）：996-1000.
　　[9] 赵玉斌，张少华 ，王金清，等.乳腺癌组织EphA2和EphrinA1蛋白表达及其临床意义的探讨[J].中华肿瘤防治杂志，2011，18（7）：513-516.
　　[10] 吴福红，姚阳.EphA2蛋白表达与结直肠癌浸润性及微血管生成的关系[J].现代肿瘤医学，2011，19（11）：2268-2271.
　　[11] 朱国臣，肖大江，陈琦，等.鼻咽癌组织中EphA2的表达变化及其意义[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，2011，25（18）：827-829.
　　[12] 阎红娥，袁鲁娜，鲍文华.EphA2和KAI-1在非小细胞肺癌中的表达及意义[J].黑龙江医药科学，2010，33（6）：26-27.
　　[13] 刘辉，郭建文，刘江惠，等.EphA2/EphrinA1在胃癌组织中的表达及与血管生成的关系[J].第三军医大学学报，2008，30（23）：2183-2186.
　　[14] Giannelli G，Antonaci ical and clinical relevance of Laminin-5 in cancer[J].Clin Exp Metastasis，2000，18（6）：439-443.