人TNFα重组慢病毒载体构建及其脐血间质干细胞

【关键词】 慢病毒感染;遗传载体;肿瘤坏死因子α;基因;脐血;间质干细胞

【摘要】 目的 构建带有人tnfα基因的慢病毒载体，并且观察该基因在体外人脐血间质干细胞中的表达。方法 通过逆转录聚合酶链反应(rtpcr)从pcd dnatnfα质粒中获得人tnfα基因，利用infusion技术重组构建慢病毒载体穿梭质粒pgcfutnfα，在脂质体lipofectamine 2000介导下与结构质粒phelper 1.0和包膜质粒phelper 2.0共转染293t细胞包装生产慢病毒。将人脐血间质干细胞分为实验组(pgcfutnfα)、空载体对照组(pgcfuegfp)及空白组(脐血间质干细胞)，分别用重组慢病毒、空载慢病毒、pbs感染后，采用rtpcr以及elisa方法检测tnfα表达。结果 所获tnfα基因测序证明与genbank中序列一致;重组慢病毒载体质粒pgcfutnfα经鉴定正确;三质粒共转染293t细胞成功，收集、浓缩病毒后测定其滴度为2×107 tu/l，感染脐血间质干细胞后rtpcr、elisa检测3组细胞均有tnfα表达,其中实验组大量表达tnfα,与其余两组比较差异有显著性(f=11.677、21.321，p<0.01)。结论 成功构建带有tnfα基因的慢病毒载体并实现在脐血间质干细胞中的表达，为脐血间质干细胞转基因治疗胃癌的应用奠定基础。wWW.lw881.com

【关键词】 慢病毒感染;遗传载体;肿瘤坏死因子α;基因;脐血;间质干细胞

　construction of lentiviral vector carrying tnfα gene and its expression in human umbilical cord blood mesenchymal stem cells ma guiliang, mao weizheng, yang kun, et al (department of general surgery, the affiliated hospital of qingdao university medical college, qingdao 266003, china); [abstract] objective to construct a lentiviral vector carrying human tnfα gene,and observe its expression in human umbilical cord blood mesenchymal stem cells (ucbmscs). methods human tnfα gene was obtained with reverse transcription polymerase chain reaction (rtpcr) from pcd dnatnfα plasmid. the tnfα gene was recombined to construct the transfer plasmid pgcfutnfα by infusion technique. the 293t cells were cotransfected with the transfer plasmid pgcfutnfα, the construction plasmid helper 1.0 and the envelope plasmid helper 2.0 with the help of lipofectamine 2000 to produce lentiviral particles. human ucbmscs were divided into experimental group (pgcfutnfα), mock group (pgcfuegfp) and blank group (ucbmscs), which were infected by recombinant lentiviral particles, empty lentiviral particles and pbs, respectively. the expression of tnfα was observed by rtpcr and elisa. results the results of gene sequencing showed that the cloned tnfα gene was consistent with the sequence reported in genbank. the pgcfutnfα plasmid was identified to have correct sequence. after the three plasmids of lentiviral vectors were cotransfected to the 293t cells, the supernatant was collected and concentrated. the titer of the lentiviral vector particles was 2×107 tu/l. after the constructed lentiviral vectors infected the ucbmscs, tnfα expression detected with rtpcr and elisa was found in all three groups, but the expression of tnfα in the pgcfutnfα group was significantly higher than that in the pgcfuegfp group and the ucbmscs group at both mrna and protein levels (f=11.677,21.321;p<0.01). conclusion lentiviral vector carrying tnfα gene has been successfully constructed. the infected human ucbmscs can express tnfα protein. the results of present study provide basis for application of ucbmscs gene transfer therapy in the treatment of gastric carcinoma.

　　[key words] lentivirus infection; genetic vector; tumor necrosis factoralpha; gene; umbilical cord blood; mesenchymal stem cell

　　肿瘤坏死因子α(tnfα) 是一种重要的免疫调节因子, 具有杀伤和抑制肿瘤的作用[1]。 体外研究表明，tnfα是目前发现最有效的肿瘤杀伤因子之一，但全身给药难以达到体外实验中有效的抗肿瘤效果。脐血间质干细胞具有多向分化潜能及定向肿瘤部位迁移并构成肿瘤间质的特性[2]。本实验通过构建人tnfα重组慢病毒感染脐血间质干细胞使其成为tnfα基因的载体，观察tnfα在脐血间质干细胞中的表达。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验材料

　　细胞和质粒:慢病毒表达载体穿梭质粒pgcfu vector (含有egfp基因)和慢病毒结构质粒phelper 1.0 及慢病毒包膜蛋白质粒phelper 2.0，购自 genechem公司; 感受态大肠埃希菌dh5ɑ、tnfα基因表达质粒pcd dnatnfα，来自我院中心实验室;人胚肾上皮细胞系293t细胞、人脐血间质干细胞，来自我院中美干细胞中心。试剂和引物：限制性内切酶ageⅰ，neb公司;infusion kit，bd公司;taq polymerase，takara公司;primer，上海吉凯基因技术有限公司;bsa，上海捷倍思基因技术有限公司;lipofectamine 2000， invitrogen 公司;plasmid 抽提 kit，qiagen公司;pcr提取kit，宝生物(大连)有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 引物设计与合成 根据pgcfu vector的要求在引物中加入age ⅰ酶切位点accggt，用于pcr扩增tnfα基因，f: 5′caggatccccgggtaccggtcgccaccatgagcactgaaagcatgatc3′;r:5′tcaccatggtggcgaccggtaccagggcaatgatcccaaag3′， 产物大小为527 bp。pcr 鉴定目的基因重组连接的阳性克隆菌落,其中f:5′tgacaagcctgtagcccat3′,r:5′cgtcgccgtccagctcgaccag3′，产物大小为527 bp。tnfα基因引物，f：5′tgacaagcctgtagcccat3′，r：5′cgtcgccgtccagctcgaccag3′。内参gapdh 基因引物，f：5′aacagcctcaagatcatcagcaa3′,r：5′gactgtggtcatgagtccttcca3′。上述引物设计与合成均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

　　1.2.2 重组慢病毒载体质粒的构建 采用pcr技术从pcd dnatnfα中扩增目的基因(tnfα)，pcr反应条件:94 ℃变性30 s后，94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,共20个循环,最后再于72 ℃延伸10 min。用ageⅰ酶分别酶切载体pgcfu vector和上述pcr产物,琼脂糖电泳分离纯化。将酶切回收载体dna、酶切回收的pcr产物、infusion交换酶及buffer与ddh2o加入反应体系，于23 ℃反应15 min,再于42 ℃反应15 min制备克隆交换液,转化dh5ɑ。pcr 鉴定细菌阳性克隆, 命名为pgcfutnfα,送往上海生工基因公司测序。

　　1.2.3 病毒的包装、收集 用lb培养液扩增转化菌dh5ɑ,plasmid 抽提 kit提取骨架质粒pgcfutnfα、包装质粒phelper 1.0、phelper 2.0。转染前24 h,用胰蛋白酶消化对数生长期的293t细胞,以含体积分数0.10 血清的培养基调整细胞密度为6.0×108/l,重新接种于15 cm 细胞培养皿,37 ℃、体积分数0.05 co2培养箱内培养24 h，待细胞达70%～80%融合时即可用于转染。转染前24 h 将细胞培养基更换为无血清培养基。应用慢病毒穿梭质粒、结构质粒和包膜蛋白质粒,按invitrogen公司lipofectamine 2000使用说明进行共转染包装细胞293t细胞，细胞转染后8 h更换为完全培养基,培养48～72 h后观察，出现强绿色荧光并有细胞融合现象时，收集含慢病毒颗粒的细胞上清液,对其浓缩后得到高浓度的慢病毒浓缩液, 分装后保存在病毒管中,-80 ℃保存。

　　1.2.4 病毒滴度测定 ①逐孔稀释滴度测定法检测病毒滴度：分别取10 倍比稀释的病毒液100 μl,加入96孔板,8 h后,换为新鲜培养基。4 d后,观察细胞荧光及生长状况,并收取细胞进行后续滴度测定。 ②实时荧光定量pcr检测病毒滴度:抽提细胞总rna,逆转录获cdna。以gfp基因引物(f:5′tgcttcagccgctaccc3′,r:5′agttcaccttgatgccgttc3′)、actin基因引物(f:5′gtggacatccgcaaagac3′,r:5′aaagggtgtaacgcaacta3′)两步法行实时荧光定量,95 ℃预变性15 s;95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸30 s,共40 个循环，制作熔解曲线。

　　1.2.5 重组慢病毒pgcfutnfα在脐血间质干细胞中的表达检测 ①脐血间质干细胞的培养与感染：脐血间质干细胞加入含体积分数0.10胎牛血清的低糖dmem 细胞培养基(gibco)中，置37 ℃、体积分数0.05的co2饱和湿度的孵箱中培养。 当细胞长到80%融合时，用2.5 g/l胰酶消化,将脐血间质干细胞分3组接种于6孔板, 实验组为带有tnfα基因慢病毒感染的脐血间质干细胞 (pgcfutnfα组), 空载体对照组为未携带任何目的基因慢病毒感染的脐血间质干细胞(pgcfueg　fp)，空白组为未经感染的脐血间质干细胞, 每孔细胞数为5×104个。待细胞融合度达到30%，换液加入2 ml低糖dmem培养液, 10 g/l的polybrene 1 μl, 实验组加入感染复数(moi值)为10的重组慢病毒 10 μl, 空载体对照组加入空载慢病毒1 μl，空白组加入pbs 1 μl，72 h后观察荧光。② rtpcr 检测:分别抽提3组细胞总rna,加入gapdh基因引物作为内参, 同时加入tnfα基因引物行rtpcr 反应以及灰度分析,检测各组脐血间质干细胞中tnfα基因mrna表达情况。每组随机读取5 次灰度分析数据,取二者比值平均值。③ elisa检测：收集3组上清行tnfα蛋白检测,按elisa试剂盒说明书操作,检测不同浓度tnfα标准品及各组细胞上清液在波长450 nm处吸光度(a)值,根据a值计算各组上清液tnfα浓度。

　　1.3 统计学处理

　　应用ppms 1.5统计学软件[3]进行数据处理，结果以±s表示，数据间比较采用方差分析，两两比较采用q检验。

　　2 结 果

　　2.1 慢病毒载体表达质粒pgcfutnfα 构建

　　电泳结果示，748 bp 处有特异条带,与预计产物大小一致,表明已成功提取tnfα 基因(图1); 慢病毒载体酶切后琼脂糖凝胶电泳图谱见图2; tnfα重组质粒阳性克隆pcr 鉴定,琼脂糖电泳可见527 bp 目的片段,与预计pcr产物大小一致,初步确认成功构建重组质粒(图3)。测序结果显示，pgcfutnfα中tnfα序列与genbank中正常nm_000594序列完全一致。

　　2.2 包装细胞293t 细胞转导pgcfutnfα 质粒后绿色荧光蛋白(egfp)的表达

　　将pgcfutnfα质粒转导入293t细胞后,其tnfα蛋白的表达与egfp的表达是一致的。将pgcfutnfα质粒和包装质粒phelper 1.0、 phelper 2.0 共同转染293t细胞12 h后,在荧光显微镜下可以看到egfp的表达呈阳性。

　　2.3 携带重组慢病毒的包装和病毒滴度

　　本文三质粒共转染293t细胞, 成功包装表达tnfα基因和egfp基因的慢病毒pgcfutnfα，实时荧光定量pcr 结果显示，3～10 μl 样品和其后更低稀释度样品之间基因表达有一定差异,其后样品基因表达和空白对照组相比差异无显著性,因此评估3～10 μl 样品中仍有病毒颗粒,该批病毒的滴度为2 ×107tu /l，actin 及感染样品熔解曲线均呈单峰,可排除引物二聚体影响。

　　2.4 慢病毒感染人脐血间质干细胞表达情况

　　2.4.1 慢病毒感染人脐血间质干细胞绿色荧光蛋白的表达 病毒感染人脐血间质干细胞 72 h后，荧光显微镜观察，实验组可见绿色荧光,分布于胞膜位置,荧光随着细胞传代可持续;空载体对照组见较强绿色荧光;空白组未见绿色荧光。

　　2.4.2 tnfα基因mrna表达 电泳结果显示，186 bp 处有特异条带,与预计产物大小一致,表明3组均有tnfα基因mrna的表达(图4)。空白组为6.03±0.88, 实验组为2.71±1.57, 空载体对照组为4.63±1.32，实验组与空载体对照组及空白组比较差异有显著意义(f=11.677,p<0.01),空载体对照组与空白组之间比较差异无显著意义(p>0.05)。

　　2.4.3 各组上清液tnfα浓度的测定 空白组为(0.76±0.11) mg/l，实验组为(91.32±0.23)mg/l, 空载体对照组为(0.70±0.25)mg/l，实验组与空白组及空载体对照组比较差异有显著意义(f=21.321,p<0.01),空白组与空载体对照组之间差异无显著性(p>0.05)。

　　3 讨 论

　　近几年的研究显示，多种细胞因子对恶性细胞有杀伤作用。tnf是1975年首次由carswell等[4]发现，经卡介苗注射或细菌内毒素感染的小鼠血清中含有一种可引起荷瘤动物的肿瘤组织出血坏死的物质，该物质对体外培养的多种肿瘤细胞株具有细胞毒作用。lienard等[5]用tnfα进行隔离性肢体灌流法治疗肢体软组织肿瘤和骨肉瘤取得了轰动成果。tnfα可通过tnfα受体诱导肿瘤细胞凋亡，促进免疫细胞增殖分化，影响肿瘤局部血管，提高肿瘤血管内皮细胞通透性，促血栓形成，抗肿瘤新生血管形成抑制肿瘤生长。然而，临床研究显示，以全身给药的方式应用tnfα，即便给药量达到人体的最大耐受量，也难以达到体外实验中有效的抗肿瘤增殖的浓度。其原因可能与循环系统对其清除以及半衰期较短有关。tnfα大剂量应用产生的副作用较多，也限制了其全身给药。本实验目的在于寻找tnfα载体，使其在肿瘤局部持续低浓度释放，既达到杀伤肿瘤细胞作用，又使副作用最小，即转基因载体。

　　常用的转基因载体如腺病毒并不像其他病毒一样整合到宿主细胞的基因组中,而是作为dna 游离体存在于细胞核中,所以其介导的基因不能稳定表达,常随着时间流逝而出现目的基因的丢失现象。慢病毒载体是一种以hiv1为基础构建的新型的载体系统，慢病毒载体具有既能感染分裂活跃期细胞,又能高效率感染分裂缓慢或非分裂期细胞的功能;它能够携带较大及多个外源性基因,转染后对转录沉默作用有较强的抵抗力,能长期稳定表达目的基因，不易诱发宿主免疫反应等优点[6]。因此，本实验应用慢病毒作为tnfα基因载体。

　　脐血间质干细胞形态和生物学特点与骨髓源性间充质干细胞相似[7],并具有易于采集保存, 供者无痛苦, 不涉及伦理问题, 传播疾病概率低，免疫原性较弱，具有免疫调节作用，同时更为原始，扩增能力更强，含有干细胞丰富等优点，可作为骨髓间充质干细胞的替代细胞，用于各系统疾病的细胞移植、基因治疗以及移植，发挥其免疫抑制作用以减少移植后移植物抗宿主病的发生[8]。最近的动物实验及临床研究均显示，当特定的细胞更新或组织重塑环境，如代谢性骨病造成多处骨折或产前的胚胎发育时，其可提供信号促使hmsc运输到损伤部位，并进行增殖修复损伤组织。肿瘤的生长也需要间质的支持，在肿瘤间质形成的过程中，其所形成的微环境与创伤修复的环境相似，可导致间质干细胞定向趋动到肿瘤部位构成间质，从而可以作为肿瘤治疗效应物质的一种载体[9]。我们前期研究也表明，人脐血间质干细胞也可以趋向肿瘤组织构成间质，因此人脐血间质干细胞可作为tnfα基因的载体[10]。

　　akira等[11]应用腺病毒携带ifnβ基因感染bmscs (bmscifnβ)动脉注射证实，bmscs能够构成脑胶质瘤间质并局部高浓度释放ifnβ起到有效抗肿瘤效果。目前，国内外有许多慢病毒载体介导缝隙连接蛋白43(cx43)、血管生长素1(ang1)、骨形态发生蛋白质(bmp2)感染骨髓间质干细胞的研究，但尚未见慢病毒载体介导的tnfa感染脐血间质干细胞的实验研究报道。本实验以慢病毒携带tnfα基因感染人脐血间质干细胞，其moi为10的感染率为90%以上，感染效率高;rtpcr验证其在分子水平能较高地表达mrna，elisa证实感染后的msc能够较高水平地表达tnfα蛋白，说明慢病毒以及脐血间质干细胞作为基因治疗的载体有较大的优越性，为脐血间质干细胞构成肿瘤间质持续低浓度分泌tnfα达到治疗胃癌的目的提供理论基础。

【参考文献】
　[1]old l necrosis factor (tnfα)[j]. science, 1985,230:630632.

　　[2]barry f p, murphy j m. mesenchymal stem cells:clinical applications and biological characterization[j]. int j biochem cell biol, 2004,36(4):568584.

　　[3]周晓彬,纪新强,徐莉. 医用统计学软件ppms 1.5的组成和应用特点[j]. 齐鲁医学杂志, 2009,24(1):2932.

　　[4]carswell e a, old l j, kassel r l, et al. an endotoxininduced serum factor that causes necrosis of tumors[j]. proc natl acad sci usa, 1975,72(9):36663670.

　　[5]eggermont a m, koops h, lienard d, et al. isolated limb perfusion with highdose tumor necrosis factoralpha in combination with interferongamma and melphalan for nonresectable extremity soft tissue sarcomas: a multicenter trial[j]. clin oncol, 1996,14(10):26272630.

　　[6]庞凤. 用于肿瘤基因治疗的慢病毒载体研究进展[j]. 青岛大学医学院学报, 2009,45(5):493497.

　　[7]marion n w, mao j j. mesenchymal stem cells and tissue engineering [j]. methods enzymol, 2006,420:339361.

　　[8]kern s, eichler h, stoeve j, et al. comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue[j]. stem cells, 2006,24(5):12941301.

　　[9]studeny m, frank c m, jennifer l, et al. mesenchymal stem cells: potential precursors for tumor stroma and targeteddelivery vehicles for anticancer agents[j]. nat cancer ins, 2004,96(21):15931603.

　　[10]刘超,毛伟征,赵宝成,等. 细胞因子诱导杀伤细胞对裸鼠胃癌移植瘤的靶向抑制作用[j]. chin j cancer biother, 2009,16(3):267271.

　　[11]akira n, frank m, toshiyaki a, et al. human bone marrow: derived mesenchymal stem cells in the treatment of gliomas[j]. cancer res, 2005,65(8):33073317.