携带AFP基因慢病毒载体制备并感染树突状细胞的

【摘要】 目的: 制备携带afp基因的慢病毒, 并体外感染树突状细胞(dc) , 制备afpdc疫苗。方法: 以人hepg2肝癌细胞cdna为模板pcr 扩增出afp基因片段, 将该片段克隆入慢病毒载体, 构建成lentiafp慢病毒载体。其后, 用慢病毒载体转染293t细胞, 包装慢病毒表达载体。通过酶切、 pcr对lentiafp慢病毒载体进行鉴定。包装好的慢病毒体外感染dc, 制备afpdc疫苗, 流式细胞仪检测感染率, 免疫荧光、 rtpcr 法及电化学发光法检测afp表达。结果: 酶切、 pcr鉴定证实, 慢病毒载体插入片段为afp基因。包装的慢病毒具有良好的感染性, 可以在293t细胞中形成病毒颗粒, 携带afp基因的慢病毒感染dc, 经免疫荧光、 rtpcr法及电化学发光法证实dc能够表达转染基因afp, 并且不会影响dc表型, 感染率高达78.91%。结论: 成功构建携带afp基因的慢病毒载体, 感染树突状细胞后表达afp, 为dc疫苗在肝癌中的临床应用提供了实验基础。

【关键词】 甲胎蛋白; 慢病毒; 基因转染; 树突状细胞

甲胎蛋白(alphafetoprotein, afp), 是一种重要的胚胎期及肝癌相关蛋白, 正常情况下新生儿出生后, afp表达即被关闭。但如果肝细胞发生癌变或发生化学或物理损伤时, afp基因又可重新表达。afp的表达量异常增高, 临床上可作为肝癌的一个诊断和预后指标。因此, 制备afp特异性的疫苗, 诱导针对afp的特异性的免疫反应, 可作为肝细胞癌治疗的一种新思路。树突状细胞(dendritic cell, dc)是体内功能强大的专职性抗原提呈细胞, 它能够高效的摄取、 处理抗原, 并将处理后的多肽呈递给静息型t细胞, 引起针对该抗原的特异性免疫反应。dc应用于肝癌免疫治疗是目前的研究热点, 用afp基因修饰dc, 一些方法被证实有效[1, 2]。本研究中, 我们构建了人afp慢病毒表达载体, 并应用该载体感染dc, 制备afpdc疫苗, 为dc疫苗在肝癌中的临床应用提供实验基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 慢病毒载体系统(tronolab)由中国科学院上海生化细胞所提供, 该病毒包装系统为四质粒系统, 组成为prsvrev、 pmdlgprre、 pmd2g、 pwpxlmod2, 其中载体质粒pwpxlmod2能表达绿色荧光蛋白(gfp)、 prsvrev、 pmdlgprre, pmd2g含有病毒包装所必须的元件。限制性内切酶bamhⅰ、 salⅰ购自takara公司。包装细胞293t细胞株购自atcc, 高感受态dh5α购自博大泰克公司, 转染用试剂trizol、 lipofectamine2000、 胎牛血清、 胰蛋白酶均购自invitrogen公司。il4 、 gmcsf及tnfα购自bioscience公司, afp肿瘤标志物检测试剂盒购自罗氏公司, 人肝癌细胞系hepg2为我科保存。

　　1.2 方法

　　1.2.1 pcr方法获取基因片段 根据afp基因信息设计基因合成引物: 上游引物5′端带有bamhⅰ切点, 下游引物5′端带有salⅰ切点, 上游5′atttggatcccgccaccatgaagtgggtggaatcaat3′, 下游5′agacgtcgactcattaaactcccaaagcagc3′。根据说明书用trizol试剂从人hepg2肝癌细胞中抽提总rna, 并利用rtpcr 反转录成cdna, 以该cdna为模板利用上述引物做pcr扩增得到afp 基因片段 。pcr反应体系为: 模板1 μl , 10× la buffer 2 μl, dntp 2 μl, kodplus 1.0 μl , primers 1.0 μl , h2o加至20 μl反应体系。pcr反应条件为: 94℃预变性5 min, 94℃变性45 s、 52℃退火45 s和68℃延伸90 s, 循环数35, 最后经72℃总延伸10 min 。目的产物经琼脂糖凝胶电泳分离、 回收, 获得afp基因片段。

　　1.2.2 慢病毒载体lentiafp的构建及酶切鉴定 将pcr产物全部进行凝胶电泳后回收, 对慢病毒空载体pwpxlmod2和pcr的回收产物分别用bamhⅰ和salⅰ进行双酶切, 酶切目的片段用dna 纯化试剂盒进行纯化, 再用t4连接酶将双酶切载体和目的基因片段进行连接反应。取5 μl连接产物转化入dh5α高效感受态细胞, 在含氨苄青霉素的lb 平板上37℃培养过夜。经pcr 及bamhⅰ和salⅰ双酶切鉴定后筛选出正确阳性克隆, 最后取一个正确连接的质粒送出测序进一步确认, 即lentiafp。

　　1.2.3 lentiafp慢病毒的制备 用磷酸钙法转染293t细胞制备lentiafp慢病毒。将处于对数期生长的密度为2.5×106/l 293t细胞接种于的10 cm细胞培养皿中, 37℃、 50 ml/l co2培养箱内培养, 24 h后, 当细胞密度达60%～70%时转染。磷酸钙沉淀1 ml/10 cm盘, 向混合物(慢病毒质粒pwpxlmod2afp, 包装质粒, cacl2)中缓慢滴加入2×hbs 500 μl, 滴加同时注意混合以防止形成大颗粒的沉淀。静置20 min, 逐滴滴加入待转染的10 cm盘。转染8 h后吸去培养液, 用pbs洗去残余磷酸钙沉淀, 换新鲜培养液。72 h后收集细胞培养液, 室温3 000 r/min离心5 min, 收集上清并过0.45 μm的滤膜, 以除去混有的细胞或细胞碎片。将上清转入超速离心管中, 4℃、 26 000 r/min超速离心2 h。弃上清, 用约200 μl不含血清的dmem重悬病毒, -70℃储存待用。

　　1.2.4 慢病毒载体lentiafp感染dc 抽取健康人外周静脉血200 ml , 肝素抗凝(20 u/ml 全血) , 用ficoll分离外周血单个核细胞(pbmc)。将所分离的pbmc 用含50 ml/l人ab血清、 100 u/ml青霉素、 100 mg/l链霉素、 30 μg/l l谷氨酰胺、 1 000 u/ml il4和500 u/ml gmcsf的rpmi1640液重悬成2×106细胞/l , 于6孔培养板中, 37℃、 50 ml/l co2培养箱中培养, 培养的细胞在贴壁50%时加入lentiafp慢病毒(moi=10), 加入lentiegfp慢病毒(moi=10)作为对照组, 倒置荧光显微镜每隔12 h观察, 72 h后收集细胞, facs检测gfp阳性细胞数。培养第3 天, 半量补充il4 和gmcsf。培养到第6天加入tnfα (100 μg/l), 继续培养24 h后收集细胞。

　　1.2.5 rtpcr检测afp的表达 分别收集2组感染后48 h和72 h的dc, 用qiagen rna minikit抽提细胞高纯度rna, 通过rtpcr检测afp在mrna 水平的表达变化。

　　1.2.6 电化学发光法检测afp的浓度 分别收集2组慢病毒lentiafp感染72 h的dc培养上清液10 μl, 用afp肿瘤标志物检测试剂盒, 通过e170电化学发光检测仪检测afp的分泌水平。

　　1.2.7 dc表型检测 收集培养7 d的dc, 将细胞密度调整为1×109/l, 取细胞悬液100 μl/管, 分别加入cd80fitc、 cd86pe、 cd83fitc、 hladrfitc、 和cd1ape单克隆抗体各15 μl, 混匀后置室温下暗室反应30 min, 加pbs缓冲液, 1 000 r/min 5 min离心洗涤后, 以10 g/l多聚甲醛固定备作流式细胞仪检测。cell quest软件进行分析。

　　1.2.8 统计学分析 全部数据以x±s表示, 应用spss11.5 统计软件分析, 各实验组之间的比较采用t检验。p<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 pcr方法获取基因片段 取rtpcr扩增的产物5 μl进行琼脂糖凝胶电泳, 显示在1 830 bp处有扩增条带, 片段大小与理论预期值一致(图1)。

　　.2.2 慢病毒载体lentiafp的构建及酶切鉴定 构建出的慢病毒载体lentiafp用bamh i/sal i双酶切, 取酶切产物10 μl, 琼脂糖凝胶电泳分别在大约9.8 kb和1 830 bp 处可见一条带。测序结果进一步证实克隆的序列完全正确(图2)。

　　2.3 lentiafp慢病毒的制备 lentiafp感染293t细胞后, 在倒置显微镜下观察, 可见转染12 h后的细胞明显增大、 呈球形, 细胞核变大, 变圆, 贴壁能力下降而易脱落。感染24 h、 48 h后 , 在倒置荧光显微镜下观察, 发生同源重组的病毒, 可见报告基因绿色荧光蛋白( gfp) 的表达(图3)。

　　2.4 lentiafp慢病毒感染dc lentiafp慢病毒以moi=10感染dc, 48 h、 72 h分别在荧光倒置显微镜下可观察到被感染的阳性细胞有绿色荧光蛋白表达(图4)。通过流式细胞仪检测, 感染效率为78.91%左右。

　　图3 慢病毒载体lentiafp混合质粒转染293t细胞24 h(a)和48 h(b) gfp荧光照片(×100)

　　图4 慢病毒载体lentiafp感染dc(moi=10)48 h(a)和72 h(b)的荧光照片(×100)2.5 rtpcr检测afp的表达 用lentiafp感染dc 24 h和48 h 后, 提取总rna并反转录成cdna, 进行pcr检测afp的表达, 结果均得到一条1 830 bp 左右的条带, 表明有相应的mrna转录, 而对照组为阴性(图5) 。

　　2.6 电化学发光法检测afp的浓度 通过e170电化学发光检测仪, 检测到lentiafp感染dc组afp的含量为230.8 μg/l, 而对照组未检测到afp的表达。

　　2.7 dc的表型特点流式细胞仪检测 facs分别检测lentiafp转染dc 7 d后的表型结果显示cd80fitc、 cd86pe、 cd83fitc、 hladr fitc和cd1ape表达量, 相对于对照组(lentiegfp感染的dc)无统计学意义(p>0.05, 表1)。　表1 dc免疫表型分析

　　3 讨论

　　将dc疫苗回输人体内治疗肿瘤, 是肿瘤治疗的一个重要发展方向。目前国内外已大量开展这方面的研究[3, 4]。主要的方法有在体外dc培养中加入肿瘤匀浆或纯化蛋白, 或直接将抗原通过质粒或病毒载体导入dc, 输入体内后激活cd8+和cd4+ t细胞[5]。afpcdna 真核表达载体体外转染dc的研究已取得明确的进展[6]。以携带肿瘤特异性抗原基因的病毒载体感染dc, 可使抗原基因在dc中高表达, 提高其表面共刺激分子的表达, 刺激机体产生特异性的抗肿瘤免疫反应。病毒载体感染效率的高低, 往往决定诱导特异性免疫反应的强弱, 是抗原提呈和表达的关键。慢病毒载体不仅能感染不分裂细胞, 无插入致突变性, 且具有转染率高, 免疫反应小的特点。doi等[7]用带有绿色荧光蛋白序列的慢病毒进行的动物实验表明绿色荧光蛋白在动物体内、 外均可长期高表达, 未发现任何毒性反应。negre等[8]报道了慢病毒载体感染dc, 当moi为10时, 不成熟及成熟dc 的感染率分别为10% 和32% , 被感染dc 的表型与正常dc 基本无异。evans等[9]以慢病毒载体转染外周血cd34+ 干细胞来源的dc后能高表达目的抗原gfp, 且仍保持dc表型特征, 如高表达的cd1a、 cd83、 cd80和hladr等。本研究以人hepg2肝癌细胞的cdna为模板扩增得到afp 基因片段, 并将该片段插入慢病毒载体基因片段中, 成功构建了lentiafp重组慢病毒载体。经酶切、 pcr及dna序列分析鉴定证实插入片段为afp基因。为了提高lentiafp重组慢病毒载体的感染效率, 我们将该病毒载体进行了包装处理, 包装的慢病毒具有良好的感染性, 可以在293t细胞中形成病毒颗粒。将包装好的携带afp基因的慢病毒感染dc, 经荧光检测和rtpcr 法鉴定证实dc内存在有转染的afp基因; 经facs检测慢病毒感染率可达78.91%; 用e170电化学发光检测到lentiafp慢病毒感染dc中afp的表达情况, 结果发现dc中afp的含量高达230.8 μg/l, 说明lentiafp慢病毒感染dc后, afp可在dc中高效表达; 检测两组dc表型表达量无显著性差异, 说明重组慢病毒lentiafp感染dc后可以表达afp, 且不会明显诱导dc凋亡, 不影响dc的表型。研究结果表明, 我们构建的含人afp基因的慢病毒能够体外感染dc, 感染效率高, 较一般的慢病毒载体感染dc的感染率高出2倍以上, 并且成功表达目的基因afp。应用afp基因感染dc制备的lentiafp dc疫苗有望成为肝癌的一种免疫治疗手段, 为进一步研究dc疫苗在肝癌中的临床应用创造了条件。

【参考文献】
　　[1] nakaya h. in vitro model for the suicide gene therapy of afp producing gastric cancer using hsv tk gene under control of afp promoter[j]. hokkaido igaku zasshi, 2003, 78 (3): 203-209.

　　[2] ritter m, ali my, grimm cf, et al. immunoregulation of dendritic and t cells by alphafetoprotein in patients with hepatocellular carcinoma[j]. j hepatol, 2004, 41(6): 999-1007.

　　[3] butterfield lh, ribas a, dissette vb, et al. a phase i/ii trial testing immunization of hepatocellular carcinoma patients with dendritic cells pulsed with four alphafetoprotein peptides[j]. clin cancer res, 2006, 12(9): 2817-2825.

　　[4] lau ah, thomson aw. dendritic cells and immune regulation in the liver[j]. gut, 2003, 52(2): 307-314.

　　[5] 曲 强, 周 立. 肝细胞肝癌免疫治疗进展[j]. 细胞与分子免疫学杂志, 2008, 24(4): 319-320.