比索洛尔与阿托伐他汀对高血压大鼠心肌纤维化

【关键词】 比索洛尔；阿托伐他汀；心肌纤维化；基质金属蛋白酶

【摘要】 　　目的 探讨单独或联合应用比索洛尔与阿托伐他汀对肾性高血压大鼠心肌纤维化的影响 方法 采用两肾一夹方法建立肾性高血压大鼠模型，将32只大鼠随机分为对照组、比索洛尔组、阿托伐他汀组、比索洛尔联合阿托伐他汀组，每组8只。12周后测量左心室重量指数（lvmi）,检测心肌羟脯氨酸（hc）浓度，苦味酸酸性品红(vg)染色检测心肌胶原容积分数（cvf）,免疫组化法检测（mmp9）基质金属蛋白酶9（mmp9）的表达水平。结果 与对照组相比，比索洛尔组与阿托伐他汀组lvmi、hc、cvf均明显降低（p<0.05），mmp9表达降低（p<0.05）,且比索洛尔组上述指标改善优于阿托伐他汀组，联合用药组较另外2组改善明显（p<0.05）。结论 比索洛尔与阿托伐他汀均能有效抑制大鼠心肌纤维化的形成，其机制与降低mmp9表达水平有关，且比索洛尔疗效优于阿托伐他汀，联合用药组疗效更加明显，二者之间存在协同作用。

【关键词】 比索洛尔；阿托伐他汀；心肌纤维化；基质金属蛋白酶

　　effects of bisoprolol and atorvastatin on myocardial fibrosis of hypertension rats

　　xi ling,li zheng,li ruxiang

　　department of geriatrics,the first hospital of shanxi medical university, taiyuan 030001,china

【abstract】 objective to investigate the effects of bisoprolol alone or combined with atorvastatin on myocardial fibrosis of hypertension s the rat models with renal hypertension were established and randomly divided into control group (n= 8),bisoprolol group (n= 8), atorvastatin group (n= 8) and bisoprolol combined with atorvastatin group (n= 8).after 12 weeks, left ventricular mass index（lvmi）was measured and myocardial hydroxyproline concentration (hc) was detected in left ventricular tissue. total collagen in left ventricular tissue was observed by van gieson staining. the expression of matrix metalloproteinase9(mmp9)was evaluated by immunohistochemical staining. results as compared with those in control group, the levels of lvmi ,hc , cvf in bisoprolol group and atorvastatin group were significantly lower than those in control group(p<0.05),and the expression of mmp9was significantly decreased(p<0.05).the improvement in bisoprolol group was better than that in atorvastatin group,which in bisoprolol combined with atorvastatin group was better than that in the other two groups(p<0.05).conclusion bisoprolol and atorvastatin can inhibit the formation of myocardial fibrosis in rats , which may be related to the decrease of expression of mmp9,and bisoprolol group is better than atorvastatin group, bisoprolol combined with atorvastatin group is much better, there is a synergy in the two drugs.

　　【key words】 bisoprolol;atorvastatin;myocardial fibrosis;matrix metalloproteinase9

心肌纤维化是多种心血管疾病（如高血压、心肌梗死、心力衰竭、心律失常、猝死等）发展到一定阶段的共同病理改变,因此，防止和逆转心肌纤维化已成为治疗心血管疾病的主要目的。β受体阻滞剂与他汀类药物已广泛应用于临床，本研究以肾性高血压大鼠为模型，观察在使用高选择性β1受体阻滞剂——比索洛尔的基础上加用阿托伐他汀对高血压心肌纤维化的影响，并探讨其逆转心肌纤维化的机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　雄性wistar大鼠32只（购于山西医科大学生理教研室，体重180～230 g），随机分为4组：对照组、比索洛尔组、阿托伐他汀组、比索洛尔＋阿托伐他汀组（联合用药组），每组8只。用10％水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔麻醉，开腹，用内径0.25 mm的银夹钳夹4组大鼠左侧肾动脉使其部分狭窄，术后4周测尾动脉收缩压，高于20 kpa者为高血压模型制备成功。比索洛尔组用蒸馏水（1 ml）溶解的比索洛尔（2 mg·kg-1·d-1）灌胃，阿托伐他汀组用蒸馏水（1 ml）溶解的阿托伐他汀（50 mg·kg-1·d-1）灌胃，联合用药组同时使用上述两种药物，对照组用等量蒸馏水灌胃，连续观察8周。

　　1.2 标本的采集与处理

　　术后12周末，用20％乌拉坦（4 ml/kg）麻醉大鼠，开胸取出心脏，以冰0.9%氯化钠溶液冲洗干净，吸干水分，去除大血管、左右心房、右心室，取左心室并称其重量［即左心室重量（lvm）］除以体重（bw）得到左心室重量指数（lvmi）。将左心室心肌标本横切分为两份，中下段部分冻存于-70℃冰箱中，另取左心室中上断横切面组织一块，经10％甲醛固定24 h，常规脱水、石蜡包埋，制成4 μm切片，分别行心肌苦味酸酸性品红(vg)染色及基质金属白酶9（mmp9）的免疫组化染色。

　　1.3 心肌羟脯氨酸浓度的测量

　　羟脯氨酸是胶原蛋白的主要成分，而且动物组织中的羟脯氨酸几乎完全来自胶原，因此，心肌组织内羟脯氨酸的含量可以代表胶原的水平，即反映心肌纤维化的程度。按试剂说明书，100 mg心肌组织匀浆、消化、水解、取上清，使用分光光度计在550 nm处测各管吸光度。羟脯氨酸（hc）浓度＝（测定管吸光度－空白管吸光度）/(标准管吸光度－空白管吸光度)×标准管含量（5 μg/ml）×水解液总体积（10 ml）/组织湿重（mg）。

　　1.4 心肌胶原纤维的半定量分析

　　组织切片进行vg胶原染色，利用图像分析系统，测量心肌胶原灰度值（反映组织化学染色产物深浅程度，灰度值越大，则反应产物浓度越小，反之，产物浓度越大）。测量心肌胶原容积分数（cvf）,cvf=胶原面积/总面积。每张切片随机取4～6个视野取其平均值。

　　1.5 mmp9表达水平的测定

　　mmp9采用sp三步法免疫组化染色，一抗为羊多抗igg（购于北京中衫金桥有限公司），二抗为spabc试剂盒（购于北京中衫金桥有限公司），按试剂盒说明书操作，利用图像分析系统进行分析，测量其灰度值，每张切片平均选取4～6个视野。

　　1.6 统计学分析

　　应用spss 10.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，p<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 4组大鼠血压、lvmi、hc及cvf结果比较

　　与对照组相比，比索洛尔组及联合用药组大鼠血压明显降低（p<0.01），而阿托伐他汀组血压略有下降，但差异无统计学意义（p>0.05）。3个实验组大鼠较对照组lvmi、hc、cvf明显改善(p<0.05)，且比索洛尔组对于改善lvmi、hc、cvf优于阿托伐他汀组（p<0.05），联合用药组改善lvmi、hc、cvf优于另外2组(p<0.05)。见表1。表1 4组大鼠心肌lvmi、hc及cvf结果比较（略）注：1 mm hg=0.033 kpa；与对照组比较，*p<0.05，#p<0.01; 与比索洛尔组比较，△p<0.05;与阿托伐他汀组比较,☆p<0.05

　　2.2 心肌胶原组织学测定

　　4组大鼠心肌vg染色，显微镜下摄图，间质胶原为紫红色，心肌细胞为黄色，实验组较对照组血管周围及心肌间质胶原明显减少。

　　2.3 4组大鼠心肌mmp9免疫组化染色及半定量分析

　　3个实验组大鼠较对照组mmp9表达明显降低,灰度值明显升高（p<0.01），比索洛尔组降低mmp9表达优于阿托伐他汀组（p<0.01），联合用药组降低mmp9表达优于比索洛尔组和阿托伐他汀组(p<0.01)。见表2。表2 大鼠心肌mmp9灰度值比较（略）注：与对照组比较，*p<0.01; 与比索洛尔组比较，#p<0.01;与阿托伐他汀组比较，△p<0.01

　　3 讨论

心肌纤维化是指心肌间质胶原浓度显著升高及胶原特性构型的改变，其形成机制非常复杂，涉及肾素－血管紧张素－醛固酮系统(raas)及多种细胞因子，而各种细胞因子在影响心肌胶原的合成和降解中的相互关系仍不十分清楚。

β受体阻滞剂可以同时阻滞交感神经系统与raas，可以降低心室率，降低心肌耗氧量，增加冠状动脉的灌注。比索洛尔是一种高选择性β1受体阻滞剂，降低血压作用确切，且有可能降低心肌细胞促炎因子，逆转心室重构。有临床试验证实β受体阻滞剂可以减退心脏功能下降,阻止并逆转左心室肥厚，改善心脏本身的收缩功能及心力衰竭患者的预后,降低病死率［1-3］。β受体阻滞剂因其独特的药理特性已成为临床及基础研究中一个热点。本研究显示,以比索洛尔为代表的高选择性β1受体阻滞剂治疗肾性高血压大鼠血压疗效确切，且有效逆转大鼠心肌纤维化，其作用与抑制mmp9的表达有关。

一系列大规模实验如4s、care、lipid等均表明他汀类药物除调脂外还具有重要的非调脂作用，如稳定粥样硬化斑块、防止心室重构、抗血栓等。他汀类的这种多效性作用正日益受到人们的重视，使其成为心血管病治疗中的基础性用药之一，其作用机制可能与抑制平滑肌细胞增殖、迁移，保护血管内膜，舒张血管，抑制心肌纤维胶原合成等有关，但他汀类药物是否可以明显降低血压及其抗心肌纤维化的具体机制仍不明确［4］。pasquale等［5］纳入887例患者进行分析结果显示：他汀类药物组的收缩压比对照组平均低1.9 mm hg。但本实验阿托伐他汀组与对照组相比，大鼠收缩压虽有下降趋势，却无统计学意义，可能与本实验的样本量较小、治疗时间短有关。

mmp9又称明胶酶b，是降解ⅳ型胶原的主要成分之一，不仅在心脏基质成分的降解中起作用，而且还调节胶原蛋白的合成。sakata等［6］用8周的大鼠给予高盐饮食制作高血压型hf的大鼠模型，第23周左心室无扩大，但mmp2和mmp9的mrna水平与酶活性水平升高。第26周左心室扩大，hf并且出现肺水肿，提示mmp2和mmp9升高早于左心室扩大，是反映心肌纤维化的早期敏感指标。tziakas等［7］的研究显示阿托伐他汀治疗可降低acs患者mmp9水平。本研究表明比索洛尔、阿托伐他汀均能有效抑制大鼠心肌纤维化的形成，其机制与降低mmp9表达水平有关，且比索洛尔疗效优于阿托伐他汀，联合用药组疗效更加明显，二者之间存在协同作用。

【参考文献】
　　1 simon t, marykrause m, funckbrentano c, et al. bisoprohol doseresponse relationship in patients, with congestive heart failure, a subgroup analysis in the cardiac insufficiency bisoprolol study (cibisi ⅱ).eur heart j，2003,24:552559.

　　2 gullestad l, manhenke c, aarsland t, et al. effect of metoprolol cr/xl on exercise tolerance in chronic heart failurea substudy to the merithf j heart fail, 2001, 3:463468.

　　3 王健兵，刘荣红，赵文增，等.比索洛尔对急性心肌梗死静脉溶栓患者细胞黏附分子和循环内皮细胞及心律失常的影响.河北医药，2009，31：24112414.

　　4 姜荣建，覃数，孔洪，等.阿托伐他汀对冠心病患者血脂及血清炎性因子水平的影响.中国全科医学，2008，11：300302.

　　5 pasquale s, sally mk. do statins reduce blood pressure’a metaanalysis of randomized ,controlled trials .hypertensions ,2007，49:792798.

　　6 sakata y, yamamoto y, mano t, et al. activation of matrix metalloproteinases precedes left ventricular remodeling in hypertensive heart failure rats: its inhibition as a primary effect of angiotensinconverting enzyme inhibitor. circulation，2004,109:21432149.
　　
　　7 tziakas dn, chalikias gk, parissis jt, et al. serum profiles of matrix metalloproteinases and their tissue inhibitor in patients with acute coronary effects of shortterm atorvastatin j cardiol,2004,94:269277.