低嘌呤啤酒酵母的发酵策略探讨

Breeding the yeast of lower purine
Student’ s name: Chen  Jiang   Advisor:Liu Shi-wang
（School of Biological and Chemical Engineering Zhejiang University of Science and Technology）

Abstract: In this paper, wort, fermenting liquor and beer were determined by HPLC, and the change of purines in fermentation process was analyzed, and proposed the effective control measure and to improve it. By the ultraviolet mutagenesis of the saccharomycetes protoplast,  screening produces the purine low strain. Take pH = 3.85 to the 0.02 mol/L phosphate buffer solution as the mobile phase liquid, and the Wavelength is 254 nm for test. The experiments show that, the conditions of protoplast’s formation is use the 1.5% of the snail-as-broken ,and 0.7mol / L of sucrose buffer for hypertonic pressure stabilizer, bath processing 3-4h in 30 ℃ water .And the conditions of UV-induced is in the ultraviolet light irradiation of 25W, Mutation 60s to make the protoplast death rate more than 80%,and the reproducibility is 5.6%. Repeated siftings and fermentation. The purine in beer content lower than the ordinary one. The research in this paper offered a reliable analytical method and the researching direction of low—purine beers．
Keywords：Yeast ;Protoplast; Mutagenesis; Highly effective liquid chromatography; Purine

目  录
中文摘要 I
英文摘要 II
目录 III
1. 绪论 1
1.1 嘌呤简介 1
1.2 啤酒中嘌呤的来源  1
1.2.1 来源于原料及酿造用水 1
1.2.2 酵母在酿造过程中产生 2
1.3 啤酒中嘌呤含量  2
1.4 本课题研究的意义 2 
2．实验部分 3
2.1 实验材料 3
2.1.1 菌种 3
2.1.2 培养基 3
2.1.3 主要仪器设备 3
2.1.4 主要药品 4
2.1.5 主要试剂 4
2.2 实验方法 4
2.2.1 啤酒酵母活化 4
2.2.2 对数期啤酒酵母培养 4
2.2.3 原生质体制备 5
2.2.4 原生质体观察 5
2.2.5 原生质体再生 5
2.2.6 原生质体诱变 6
2.2.7 麦芽汁制备 6
2.2.8 啤酒酵母发酵 6
2.2.9 HPLC法测定嘌呤 7
2.2.10菌种保存 7
3. 结果与讨论 8
3.1 原生质体制备 8
3.1.1 酶解条件的选择 8 3.1.2 紫外诱变时间的选择 9
3.1.3 显微镜镜检原生质体 9
3.2啤酒的酿造 10
3.2.1 啤酒酿造参数选择 10
3.2.2 酿造啤酒照片 10
3.3 嘌呤含量测定 10
3.3.1 色谱条件 10
3.3.2 嘌呤含量的计算及分析 10
3.3.3 改良酵母发酵啤酒中嘌呤测定 14
3.4 实验小结 16
4 总结与展望 17
4.1 总结 17
4.2 展望 17
致谢 19
参考文献 20
 
 
1  绪   论
啤酒营养丰富，素有“液体面包”之称，其中许多成分都具有保健功能，如电解质、维生素、多肽类、多糖类、多种有机酸、酚类以及酮类物质等，因此它对人体的营养功能和疗效是无可争议的事实，但长期以来医学观点认为啤酒是诱发痛风的危险因子。
痛风是嘌呤代谢异常引起的一种疾病，由于嘌呤代谢异常，引起血中尿酸含量增高，称为高尿酸血症。在某些情况下如血液病、恶性肿瘤放疗或化疗后，细胞内核酸分解增加，即合成尿酸的原料增加，也将导致血尿酸升高。长期使用某些利尿剂则使肾吸收尿酸增多。此外，血中尿酸含量的高低还取决于嘌呤的摄入、体内的合成及排泄。
人体尿酸总量为0.9-1.6克，每日更新约60%，产生750毫克，酸碱度为5.75，体液偏碱性。人体内尿酸每日生产量和排泄量大约相等。尿酸1/3是由食物而来，2/3是体内自行合成。啤酒中含有一定量的嘌呤，且酒精在体内会加速ATP代谢产生尿酸，其代谢产物——乳酸可以抑制尿酸由肾脏排泄，故容易引起痛风发作。
1.1 嘌呤简介
嘌呤分子式为C5H4N4，无色结晶，是DNA及RNA自身处于不停的新陈代谢过程中产生的一类有机化合物。嘌呤在酶的催化下进一步代谢分解，即转变为尿酸。可见，嘌呤是核酸的代谢产物，而尿酸是嘌呤的代谢最终产物，所以说尿酸是细胞分解的终末产物之一。
1.2  啤酒中嘌呤的来源
啤酒在生产过程中由于生产工艺、生产原料等因素的影响导致成品啤酒中含有一定量的嘌呤，嘌呤物质的存在，已经影响啤酒食用的安全和绿色健康啤酒的发展。
1.2.1 来源于原料(主要是麦芽)及使用水
啤酒是以麦芽为主要原料，麦芽中一般含有0.2%～0.3%的核酸类物质。在糖化时，受各种磷酸酯酶的作用，麦芽中的少量核酸酶受到激活，活性提高，核酸逐步降解为核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶等多种降解物，并生成少量游离嘌呤和嘧啶碱基。含有嘌呤碱的核酸降解产物统称为嘌呤类物质。麦汁的浓度越高，嘌呤含量就越高；随着辅料(大米)含量的增加，麦汁中各种嘌呤含量逐渐减少，这都说明麦汁的嘌呤含量主要来自于麦芽。当然，酿造用水中也存在一定的微生物，在灭菌及酿造过程中微生物被破坏，其中的核酸类物质被水解成嘌呤，因而影响了啤酒的质量。
1.2.2 酵母在酿造过程中产生
在发酵初期，酵母吸收醪液中的嘌呤碱基，可以加快合成核酸，缩短酵母的延滞期和发酵时间。酵母几乎可以利用全部的游离嘌呤碱基，但不能吸收核苷酸和核苷等嘌呤类物质，因此，啤酒中普遍含有较高的嘌呤类物质，含量为40mg/L～100mg/L，主要以核苷酸和核苷等大分子嘌呤类物质存在。
1.3 啤酒中嘌呤含量
近年来，随着酶制剂的广泛使用和新型啤酒原辅材料的研究开发，高辅料啤酒酿造技术进入了实际应用阶段，并得到了长足的发展。2002年一些公司开发的发泡啤酒将辅料比提高到了65%以上，发泡啤酒酿造工艺以糖浆和大米为主要原料，由麦芽提供酵母所需氨基酸等氮源，由于糖浆提供了大量的可发酵性糖，发泡啤酒的发酵度可达到68%以上。发泡啤酒的麦芽使用量大幅度降低，成品啤酒的嘌呤含量在3mg/100ml以下。而正常啤酒中嘌呤的含量为4～10mg/100ml。
1.4 本实验研究意义
本项目研究将为无或低嘌呤啤酒的生产提供依据，这对啤酒行业的发展具有重要意义。首先，低嘌呤啤酒是突破传统啤酒生产工艺方式的一种新尝试，啤酒中嘌呤的控制可使啤酒企业在发酵酒行业中取得先机，在即将出台的发酵酒卫生标准面前立于不败之地。
本实验研究内容主 要分为三部分：第一部分主要是研究啤酒的酵母菌生理生化形态及特征和酵母原生质体制备技术；第二部分研究是使用不同的酵母菌发酵的啤酒与市售成品啤酒通过高效液相色谱法检测嘌呤含量；第三部分研究内容将利用原生质体紫外诱变及再生技术来实现菌株的改良优化，使发酵菌在发酵过程中产生低嘌呤或者不产生嘌呤，用再生酵母发酵啤酒并检测其嘌呤含量，优选出嘌呤含量少者保存。
本实验拟解决的关键技术是控制原生质体紫外诱变，得到低嘌呤或者无嘌呤的生产酵母。利用原生质体紫外诱变，对酵母代谢产生嘌呤机理加以改造调控，并通过高效液相色谱法检测发酵啤酒中嘌呤含量，挑选优良酵母，这是完成本项目的研究内容的关键技术。

2  实验部分
2.1实验材料
2.1.1 菌种
啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiaes)（实验室保藏）
2.1.2 培养基
（1） 液体YEPD培养基：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml，调pH6.0；
（2） 固体YEPD培养基：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml，另加琼脂1.2%，调pH6.0；
（3） 固体RYEPD培养基：YEPD培养基中添加10%蔗糖（或0.7mol/L KCl），另加琼脂1.2%；
（4）麦芽汁培养基：取大麦芽125g粉碎成约60目，将麦芽粉用浸出糖化法制备麦芽汁，用碘液滴检呈黄色至无色。然后用纱布过滤，分装后在121℃灭菌15min。将制备的麦芽汁稀释到5-6波美度，pH约为6.4。
2.1.3 主要仪器及设备
（1）SW-CJ-1B型单人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）
（2）MJX-160B-Z型霉菌培养箱（上海博迅是实业有限公司医疗设备厂）
（3）HZ-9310K型落地冷冻摇床（华利达实验设备公司太仓市科教器材厂）
（4）ZDX-35BI型座式自动电热压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）
（5）LXJ-ⅡB型低速大容量多管离心机（上海安亭科学仪器厂）
（6）JA1003型电子分析天平Ⅱ（上海上平仪器公司）
（7）YS100型双目生物显微镜（南京江南光电新兴光学仪器有限公司）
（8）QE-02A型药材粉碎机（武义县屹立工具有限公司）
（9）HPLC：液相色谱water1525型泵；water2996型紫外可变波长检测器；7725i型六通进样阀；Empower工作站；色谱柱：5μm，250mm×4.0mmid。
（10）超声波清洗器（上海普天分析仪器有限公司）
2.1.4 主要药品
                 
 表1     主要药品规格及厂家
药品名称             规格                         厂家
酵母粉               BC                          富阳市杭富生物制药厂
蛋白胨               BC                          南通东海龙生生物制品有限公司
纤维素酶             BC                          上海伯奥生物科技有限公司
蜗牛酶               BC                          北京百泰生化技术公司
蔗糖                 AR                          广东光华化学厂有限公司
葡萄糖               AR                          广东光华化学厂有限公司
琼脂                 BC                          福建泉州市泉港化工厂
磷酸二氢钾           AR                          宜兴市化学试剂三厂
磷酸氢二钾           AR                          宜兴市化学试剂三厂
高氯酸               AR                          上海海曲化工有限公司
磷酸二氢钠           AR                          上海实验试剂有限公司
磷酸氢二钠           AR                          上海实验试剂有限公司
2.1.5 主要试剂
（1）蔗糖缓冲液：称取蔗糖71.862g定容至300ml配成0.7mol/L的溶液；
（2）0.2mol/L Na2HPO4 溶液：称取Na2HPO4•12H2O 71.63g，定容至1000ml，待用；
（3）0.2mol/L NaH2PO4 溶液：称取NaH2PO4•2H2O 31.2g，定容至1000ml,待用；
（4）0.2mol/L磷酸缓冲液：分别取0.2mol/L Na2HPO4 溶液和0.2mol/L Na2HPO4 溶液80.5ml和19.5ml，混匀，配成pH7.0的磷酸缓冲液；
（5）破壁酶：蜗牛酶和纤维素酶固体分别用0.7mol/L蔗糖溶液及0.2mol/L磷酸缓冲液配成1.5%浓度，待用；
（6）0.2mol/L磷酸盐溶液：分别称取1.5528g磷酸氢二钾及9.96g磷酸二氢钾，溶于4L超纯水中，配成0.2mol/L的溶液，用0.45µm滤膜过滤待用。
（7）氢氧化钾溶液：称取42.09g氢氧化钾，用50ml超纯水溶解，待用。
2.2 实验方法
2.2.1 啤酒酵母活化
接保藏菌种于固体YEPD培养基斜面培养箱30℃活化36h以上；
2.2.2 对数期啤酒酵母培养
挑取活化菌种于15ml YEPD液体培养基摇床30℃ 180 r/min 培养16h；
2.2.3 原生质体制备
   （1） 菌体收集
挑取活化菌种于15ml YEPD液体培养基摇床30℃ 180 r/min 培养16h；得到对数生长期的液体菌种，4000r/min 离心5min，弃上清夜，收集菌体，用蔗糖缓冲液洗涤二次。
（2） 细胞破壁
用1.5%的细胞破壁酶液悬浮菌体，在30℃恒温水浴处理3h；显微镜镜检酶脱壁效果。
（3） 原生质体收集
将破壁的混合液用5层擦镜纸过滤，得到的滤液1000r/min 离心3min，取上清液；再将上清液3000r/min 离心10min，得原生质体沉淀。
2.2.4 原生质体观察
（1）血球计数板法
先将盖玻片放在血球计数板的计数室上，用微量移液器或无菌滴管取已稀释好的酵母原生质体滴在盖玻片的边缘，让菌液自行渗入，多余的菌液用滤纸吸去，静置片刻，待啤酒酵母细胞全部沉降到计数室底部，在光学显微镜下观察计数，然后转移到显微摄影仪下摄影。
（2）悬滴法
通常观察酵母原生质体的常规方法为染色法与悬滴法相结合，即原生质体经染色后在凹玻片上用悬滴法进行观察，此方法具有原生质体与背景颜色反差大、易观察的优点，但实际使用时存在许多缺点，例如染色过程中易造成原生质体的损伤破裂；制作的菌液悬滴以半球型附着悬在盖玻片上，原生质体在悬滴中处于不同平面，导致只能对某一层面的原生质体进行显微观察，而不能对菌液中的所有原生质体进行计数。
2.2.5 原生质体再生
（1）原生质体再生方法：将原生质体用0.7mol/L的蔗糖缓冲液稀释10倍，吸取稀释液1ml于90mm的培养皿中，稀释液与RYEPD固体培养基混合，倒入90mm培养皿中， 30℃培养3d。
（2）将15ml YEPD液体培养基制得的原生质体沉淀用0.7mol/L的蔗糖缓冲液稀释50倍，吸取稀释液1ml于90mm的培养皿中，稀释液与RYEPD固体培养基混合，倒入90mm培养皿中， 30℃培养3d，计算单菌落数（记为C）；吸取稀释液1ml于90mm的培养皿中，稀释液与YEPD固体培养基混合，倒入90mm培养皿中， 30℃培养3d，计算单菌落数（记为B）；将15ml YEPD液体培养基离心得到的菌体用0.7mol/L的蔗糖缓冲液稀释50倍，吸取稀释液1ml于90mm的培养皿中，稀释液与YEPD固体培养基混合，倒入90mm培养皿中， 30℃培养3d，计算单菌落数（记为A）；
形成率＝（A-B）/A×100%
再生率＝（C-B）/（A-B）×100%
2.2.6 原生质体诱变
将原生质体用0.7mol/L的蔗糖缓冲液稀释10倍，吸取稀 释液1ml于90mm的培养皿中，在距紫外灯30cm处照射60s；在暗处把诱变的稀释液与RYEPD固体培养基混合，倒入90mm培养皿中，避光30℃培养2d，挑选单个菌落，在YEPD固体培养基上划线培养分离得到纯菌落；
2.2.7 麦芽汁制备
（1）粉碎：称取125g大麦芽（西湖啤酒厂提供），粉碎成约粗细颗粒比为2.5：1的粉末，加入1000ml的水；
（2）酸休止：将装混合液的烧杯放入37℃恒温水浴锅内，搅拌加热30min；
（3）蛋白休止：水浴锅温度升高至52℃，搅拌加热混合液1h；
（4）糖化分解：水浴锅温度升高至65℃，处理至吸取混合液滴加碘液不显蓝色则糖化完全；
（5）糖化终了：把水温升高至76-78℃静置10min；
（6）冷却过滤：用四层纱布过滤混合液，收集滤液；
（7）麦芽汁煮沸：加热滤液至沸腾，加入酒花（西湖啤酒厂提供）总量（2.4g/1000ml）的20%，当煮沸40min后，添加酒花总量的40%，煮沸90min后，加入剩余的酒花，并补足水；
（8）冷却过滤：冷却至4℃沉淀30min后，用脱脂棉过滤；
2.2.8 啤酒酵母发酵
（1） 菌体活化
接保藏菌种于固体YEPD培养基斜面培养箱30℃活化36h以上；
（2）培养基
种子扩大培养基：3瓶15ml麦芽汁培养基与3瓶15ml YEPD液体培养基做平行与对照实验；
啤酒酿造培养基：3瓶200ml麦芽汁培养基与3瓶200ml YEPD液体培养基做平行与对照实验；
（3） 酿造参数
种子培养：挑取活化菌种于15ml YEPD液体培养基摇床30℃ 180 r/min 培养16h；
前发酵：200ml YEPD液体培养基摇床12℃，180 r/min 培养1d ；10℃ 180 r/min 培养2d ；8℃ 180 r/min 培养1d ；
后发酵：200ml YEPD液体培养基4 ℃ 无氧培养10d；
（4）离心去酵母泥
啤酒发酵完成后，将发酵醪液于4000r/min 离心5min，弃沉淀，得到成品生啤酒。
2.2.9 HPLC法测定嘌呤
（1）样品的预处理：取10ml脱气后的啤酒于25ml的试管，加入10ml高氯酸在沸水浴中水解1小时后，迅速转入冰浴，待样品冷却后，用氢氧化钾滴定使样品pH=7，过滤，用1：1磷酸滴定滤液，使滤液的pH在3.85-3.89之间，过滤，将滤液定容至50ml。
（2）样品的测定：将样品溶液用0.2µm滤膜过滤，精密量取10µl注入液相色谱仪进行分析。
2.2.10 菌种保藏
检测啤酒中嘌呤的含量，并选出嘌呤含量少的诱变酵母，在YEPD固体培养基划线4℃保存。

3  结果与讨论
3.1 原生质体制备
3.1.1 制备条件的选择
（1）在原生质体制备过程中，在破坏细胞壁的同时，不能影响到细胞膜的完整性，更不能使细胞内部结构受到破坏，为此只能选用对细胞壁有专一性作用的酶。蜗牛酶是一种混合酶，它含有纤维素酶，果胶酶，淀粉酶，蛋白酶等20多种酶，用于啤酒酵母细胞壁的降解有较好的效果，如表2所示。
表2 不同的酶液对原生质体产率的影响
                           蜗牛酶           纤维素酶           混合酶
菌体数目（个）             4.5×107           4.7×107                    4.1×107
原生质体数目（个）         2.8×107          2.8×107             1.9×107
再生后菌体数目（个）       0.7×107          0.7×107             0.5×107
生成率（%）                62.2             59.6                46.3
再生率（%）                15.6             14.9                12.2
（2）高渗透压稳定剂不仅为了保护脱壁后的原生质体，还有利于水解酶与底物的结合。所以要注意所加入的化合物对细胞和原生质体无毒性，不会影响溶酶菌等细胞壁水解酶的活性，而且对原生质体的代谢物没有显著的不良影响，由表3所得，蔗糖缓冲体系对原生质体的制备效果最佳。
表3  不同的缓冲体系对原生质体生成率的影响
                           0.2mol/L的磷酸缓冲液         0.7mol/L蔗糖缓冲液
菌体数目（个）                  4.4×107                      4.3×107
原生质体数目（个）              2.7×107                       3.9×107
再生后菌体数目（个）            0.6×107                       0.6×107
生成率（%）                     61.4                         90.7
再生率（%）                     13.6                         13.9
从上述结论可以看出，酵母原生质体制备的条件:以1.5%的蜗牛酶作为破壁酶，0.7mol/L的蔗糖缓冲液为高渗压稳定剂，在30℃恒温水浴处理3-4h。

3.1.2 紫外诱变时间的选择
    由于致死率不能过高或过低，过低诱变效果不佳；过高则负变菌株增多，且总体存活菌株太少而无从选择，因此诱变时间对原生质体的再生有很大的影响。从表4中可以看出，随着照射时间的增长，致死率也增加了，因此选用照射时间为60s对原生质体进行诱变处理。
表4  诱变时间与致死率的关系
诱变时间(s)         20        40        60       120       180        240 
诱变前数目（个）  4.5×107    4.3×107    4.3×107    4.4×107   4.4×107    4.3×107
诱变后数目（个）  3.9×107    2.2×107    5.6×106    8.6×105   8.8×105      0
致死率（%）       13.3       48.8      87.0      98.0      98.0      100
再生率（%）       13.9       10.3      5.6       1.3        0         0
3.1.3 菌体、原生质体照片
        
       图1  菌体（×400）                         图2  原生质体（×400）
          
     图3 加酒精后的原生质体（×400）                图4  染色后的原生质体（×400）

3.2 啤酒酿造
3.2.1 啤酒酿造参数选择
（1） 前发酵：恒温摇床12℃  180 r/min 培养1d ；10℃  180 r/min 培养2d ；8℃  180 r/min 培养1d ；
（2）后发酵：4 ℃ 无氧培养10d。
3.2.2 酿造的啤酒照片
 
                          图5  不同原料发酵前后对照
3.3 嘌呤含量测定
3.3.1 色谱条件
ZORBAX SB-Aq色谱柱(4.6×250mm ，5µm)；流动相：以pH=3.85的0.02mol/L磷酸缓冲溶液作为液体流动相；腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤的最大紫外吸收分别为262.30nm、243.1 nm 、267.0 nm 、249.3 nm ，因此，以仪器默认波长254 nm 为检测波长。进样量10uL。
3.3.2 嘌呤含量的计算及分析
（1） HPLC图谱分析
根据实验，四种嘌呤含量标准曲线分别为：
鸟嘌呤：y=465095x+27631       R2=0.9985
次黄嘌呤：y=5e+07x-2052.3      R2=0.9994
    腺嘌呤：y=4e+07x-2816.3        R2=0.9962
    黄嘌呤：y=2e+07x+2635         R2=0.9988
 
图6  YEPD中嘌呤检测图谱
 
图7  麦芽汁为原料、YEPD为种子培养基检测图谱
 
图8  麦芽汁中嘌呤检测图谱
 
图9   麦芽汁为原料暨种子培养基检测图谱
 
图10 市售啤酒中嘌呤检测图谱
  根据图6-图10图谱中各组样品中的峰面积，用四种标准曲线计算出各组分中的嘌呤含量。经表5-表11比较可以看出，麦芽汁中的嘌呤含量最高，是啤酒中嘌呤的主要来源。
表5  YEPD中嘌呤的含量
嘌呤类型             出峰时间             峰面积            嘌呤 含量(mg/ml)
鸟嘌呤               14.383               80585             0.114
次黄嘌呤             15.261               104691            0.0021
腺嘌呤               17.830               15254             0.00045
黄嘌呤               18.053               94553             0.0046
表6 麦芽汁中嘌呤的含量
嘌呤类型             出峰时间             峰面积            嘌呤含量(mg/ml)
鸟嘌呤               14.054              107562              0.172
次黄嘌呤             15.409              23639               0.00051
腺嘌呤               17.710              188960              0.0048
黄嘌呤               19.160              20994               0.00092
表7  麦芽汁为原料暨种子培养基
嘌呤类型             出峰时间             峰面积            嘌呤含量(mg/ml)
鸟嘌呤               14.532               50978             0.050
次黄嘌呤             15.979               19360             0.00043
腺嘌呤               18.279               25118             0.00070
黄嘌呤               19.997               88462             0.0043
表8 麦芽汁为原料、YEPD为种子培养基
嘌呤类型             出峰时间             峰面积            嘌呤含量(mg/ml)
鸟嘌呤               14.478               58432             0.066
次黄嘌呤             17.090               12448             0.00029
腺嘌呤               18.120               54725             0.0014
黄嘌呤               19.835               15147             0.00063
表9 YEPD为原料、麦芽汁为种子培养基
嘌呤类型             出峰时间             峰面积            嘌呤含量(mg/ml)
鸟嘌呤               14.400               71374             0.094
次黄嘌呤             15.850               37136             0.00078
腺嘌呤               18.117               39702             0.0011
黄嘌呤               19.833               78315             0.0038
表10 YEPD为原料暨种子培养基
嘌呤类型             出峰时间             峰面积            嘌呤含量(mg/ml)
鸟嘌呤               14.395               84491             0.122
次黄嘌呤             15.267               78273             0.0016
腺嘌呤               18.067               102312            0.0026
黄嘌呤               19.189               31136             0.0014
表11  西湖啤酒中嘌呤含量
嘌呤类型             出峰时间             峰面积            嘌呤含量(mg/ml)
鸟嘌呤               13.663               73596             0.0988
次黄嘌呤             14.905               27098             0.00058
腺嘌呤               17.456               31386             0.00086
黄嘌呤               18.497               6724              0.00020
3.3.3 诱变菌种酿造啤酒中嘌呤含量
（1） HPLC图谱分析
从表12可以看出经过紫外诱变之后，所用菌种酿造的啤酒中嘌呤的含量明显比诱变之前要少，经过图11-图16比较可以得出，5#样品中各种嘌呤的含量较其他样品为少，因此，可以确定5#菌种的诱变效果最佳。
 
图11  1#改良酵母酿造啤酒中嘌呤检测
 
图12  2#改良酵母酿造啤酒中嘌呤检测
 
图13  3#改良酵母酿造啤酒中嘌呤检测
                     图14  4#改良酵母酿造啤酒中嘌呤检测
 
图15 5#改良酵母酿造啤酒中嘌呤检测
 
图16  6#市售啤酒中嘌呤检测图谱

表12 不同的诱变菌株酿造啤酒中嘌呤含量
样品         鸟嘌呤(mg/ml)   黄嘌呤(mg/ml)   次黄嘌呤(mg/ml)   腺嘌呤(mg/ml)
1#               0.0154         0.00126         0.00046         0.00036
2#               0.0298         0.00073         0.00032         0.00068
3#               0.0112         0.00164         0.00038         0.00048
4#               0.0168         0.00046         0.00043         0.00051
5#               0.0076         0.00041         0.00053         0.00044
6#               0.0166         0.00046         0.00055         0.00116
3.4 实验小结
   由以上实验可以看出，酵母原生质体制备的条件:以1.5%的蜗牛酶作为破壁酶，0.7mol/L的蔗糖缓冲液为高渗压稳定剂，在30℃恒温水浴处理3-4h。
酵母原生质体在25W紫外灯诱变处理，时间为60s，致死率为80%以上，用RYEPD固体培养基悬浮诱变后的原生质体。
    通过采用高效液相色谱法对麦汁、发酵液和啤酒中嘌呤含量的测定及对实验结果的分析，主要得出了以下结论：
(1) 麦汁中的嘌呤主要来自于麦芽；在发酵期间嘌呤含量有所降低，这是因为嘌呤会进入酵母细胞，构成核糖核酸、脱氧核糖核酸、三磷酸腺苷和某些辅酶。
(2) 在开发低嘌呤啤酒时，首要考虑的就是要采用高辅料比酿造技术，用糖浆或一定量的谷物作为部分麦芽的代替物来酿造啤酒，以减少啤酒中核酸类物
质的浓度；其次是采用合理的后处理工艺，如高浓稀释工艺可相对降低单位体积啤酒中的嘌呤含量，以及选择合适的吸附剂，既能减少啤酒中嘌呤的含量，又
能保证啤酒的质量

 
4.总结与展望
4.1 总结
啤酒是一种饮料酒，同时也是一种营养食品。世界各国对啤酒的需要量很大，而且出现一种不断增长的趋势。并且，随着生活水平的日渐提高，广大消费者对啤酒的品种结构和产品质量的要求也越来越高。
近年来，由于啤酒发酵方面的基础理论被逐步探明，啤酒发酵技术取得了长足的进展。在满足消费者的要求上，相应的啤酒新品种层出不穷，因而，将这方面的技术加以科学的总结和分析，以推动啤酒产品的安全性及多样化在广度和深度上的健康发展。
啤酒发酵中最本质的问题是啤酒酵母的生理代谢。啤酒生产的质量和产量都和酵母的特性有密切的关系。分子生物学及分子遗传学的进展促使啤酒酵母的研究已深入到基因分析水平。采取诱变、杂交等方法获取新的优良酵母菌种的前景是很有希望的。
根据研究所得如下结果：
（1）对原生质体进行改造，利用原生质体的各种优良实验品质来选育优良的发酵种子，是本次实验的灵魂，体现了生物工程在新时期的工作方法。实验通过采用不同的酶解条件，优化酶解方法，以此提高原生质体的制备率。实验选择1.5%的蜗牛酶为破壁酶，以.0.7mol/L蔗糖缓冲液作为渗稳剂，在30℃的恒温水浴锅中酶解3-4小时，可使原生质体的得率达到85%以上。
（2）由于原生质体致死率不能过高或过低，过低诱变效果不佳，过高则负变菌株增多，且总体存活菌株太少而无从选择，因此诱变时间对原生质体的再生有很大的影响。考虑到致死率和正、负向突变的概率，本实验选用25W紫外等照射时间为60s对原生质体进行诱变处理，使致死率达80%左右，将原生质体再生，其再生率能达到5.6%。
（3）HPLC法检测啤酒中嘌呤含量，色谱条件选用ZORBAX SB-Aq色谱柱(4.6×250mm ，5µm)；流动相：以pH=3.85的0.02mol/L磷酸缓冲溶液作为液体流动相；腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤的最大紫外吸收分别为262.30nm、243.1 nm 、267.0 nm 、249.3 nm ，因此，以仪器默认波长254 nm 为检测波长。进样量10uL。进行检测，时间为25分钟。对所得图谱进行分析，读出出峰时间及峰面积，以标准曲线公式计算各种嘌呤含量。
4.2 展望
啤酒因其富含多种氨基酸和微量元素，已成为社会各类消费者广为接受的健康营养和佐餐食品。06年全国啤酒总产量将超过3000万吨，已连续多年超过美国，稳居世界第一, 05年浙江省啤酒生产以200多万吨的产量居国内啤酒业“老二”位置。目前浙江啤酒工业已形成了近50家企业，在全国的啤酒生产中占有举足轻重的地位。
虽然我国啤酒总产量已接近3000万KL，但人均消费量仅为22L/人，仍低于世界平均水平的30L/人，更远低于欧美等啤酒业发达国家，如：捷克164L/人、爱尔兰155 L/人、德国117 L/人、美国85 L/人。故啤酒行业仍 存在巨大的发展潜力和经济效益
由于全国的传统啤酒的原料及酿造方法几乎相同，因此产品类型没有多大区别。但是啤酒新产品则不然，它们虽属于啤酒范围，但在色、香、味及成分上，与传统啤酒的典型性相距较远。很多先进的技术和科学原理，都可应用到啤酒酿造上。
啤酒发酵的进展是在对有关微生物进入深入研究的基础上取得的。对啤酒酵母的生理作用、遗传特性等方面的研究是改进啤酒发酵工艺的关键所在。为了获得高质量的啤酒，酵母及其扩大培养物应能有效的从培养基中摄取和代谢需要的营养物质，还必须赋予啤酒以良好的风味，最后酵母本身在完成它的代谢作用后，应能有效的从已发酵完的麦芽汁中除去。
啤酒工业在国内是一门年轻的工业，只有七十多年的历史。为了适应四个现代化的需要，我们必须总结国内的经验，引进和采用国外的先进技术，使国内啤酒工业能够跟上形式所需，在国际啤酒行业占一席地位。

致   谢
本论文是在导师刘士旺博士的悉心指导下完成的，导师活跃的学术思想、严谨的治学态度、渊博的知识和踏实的工作作风为我树立了榜样，让我受益匪浅。论文从设计、实验到撰写与修改，凝结了导师大量的心血，感激之余，学生在此谨致最深的谢意。
在整个的实验过程中，我们参考了大量书籍，期刊等资料，并在指导老师刘士旺博士的帮助下建立本实验方案，并帮助制定实验进度安排，使后期的操作过程中不至于中途彷徨而迷失前进的方向。感谢葛松涛同学在原生质体制备过程中提供帮助。虽然充分考虑到了实验过程中困难以及失败，但是不免因此而沮丧、失落，感谢指导老师刘士旺博士帮助及时纠正错误与调整研究方法，解决各种困惑；感谢我的家人以及同学在精神和物质上的帮助，实验的进度和各位的关心帮助是分不开的。
由于酵母在微生物研究中的重要作用，以及现代发酵工业中的普遍应用，前人已在这个领域作了很多工作，给我的实验方案的形成，以及具体的操作带来了很大的帮助。令我度过了难忘的时光。

参考文献
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