低甲醛啤酒酵母菌株的技术条件

低甲醛啤酒酵母菌株选育
葛松涛         
（生物与化学工程学院   指导教师：刘士旺）
摘 要：本论文通过乙酰丙酮分光光度法测定了麦芽汁、YEPD、发酵醪液及市售啤酒中的甲醛含量，分析了发酵醪液中甲醛的产生机理。通过酵母菌原生质体紫外诱变，筛选低甲醛酵母的菌株。实验表明，原生质体形成条件为：生长对数期的啤酒酵母在2.5%的蜗牛酶，30℃下水解180min制备，原生质体得率接近90%；紫外诱变条件为：在25W紫外灯的照射下，进行诱变2min，使原生质体致死率达80%以上，在RYEPD上再生率为5.6%，筛选菌株发酵，通过测定发酵液中甲醛含量选育得到目的菌株4#。该研究为开发低甲醛啤酒提供了可靠的检测方法和技术指导。
关键词：啤酒酵母；原生质体诱变；甲醛
Abstract: This article determines the malt culture medium, YEPD culture medium, fermentations & Xihu beer formaldehyde content by Acetylacetone Spectrophotometric Method (ASM). Analysis the solution of formaldehyde Mechanism in fermentation. Screen low-formaldehyde mutagenesis through protoplast UV. The experiments indicate that, the logarithmic Saccharomyces cerevisiaes in 2.5% snails enzymes, hydrolysis 180 min in  30℃, protoplast rate approaches 90%, & UV-induced conditions :the ultraviolet light irradiation of 25W, Mutate 2min to make the protoplast death rate more than 80%, & the reproducibility is 5.6% in RYEPD plate. Determines the formaldehyde content of fermentation get NO.4 purpose strain. The formaldehyde content in beer lower than the ordinary one. The research in this paper offered a reliable analytical method and the researching direction of low—formaldehyde beers.
Keywords: Saccharomyces cerevisiaes; Protoplast mutagenesis; Formaldehyde

1  绪   论
1.1 概述
1.1.1 啤酒生产背景
啤酒因其富含多种氨基酸和微量元素，已成为社会各类消费者广为接受的健康营养和佐餐食品。06年全国啤酒总产量将超过3000万吨，已连续多年超过美国，稳居世界第一, 05年浙江省啤酒生产以200多万吨的产量居国内啤酒业“老二”位置。目前浙江啤酒工业已形成了近50家企业，在全国的啤酒生产中占有举足轻重的地位。
随着我们国家的经济腾飞，中国啤酒产业也得到了蓬勃发展，自2002年以来，我国啤酒产量已连续三年居于世界首位。我国一些重点啤酒企业也跻身世界先进行列，装备、技术、工艺、产品已达到或接近世界一流水平，全面提高了中国啤酒业的国际地位。
虽然我国啤酒总产量已接近3000万KL，但人均消费量仅为22L/人，仍低于世界平均水平的30L/人，更远低于欧美等啤酒业发达国家，如：捷克164L/人、爱尔兰155 L/人、德国117 L/人、美国85 L/人。故啤酒行业仍存在巨大的发展潜力和经济效益。
1.1.2啤酒中甲醛现状
（1）来源
因为甲醛危害大，早在上世纪80年代初，当时的卫生部、劳动部、轻工部和卫生防疫总署就联合发文，明令啤酒行业禁止使用甲醛。但是，使用甲醛的做法在一些中小企业并没有得到扼制。
啤酒生产所使用的水，若在处理过程中管道杀菌使用甲醛，也会残留一部分在水里，从而带到啤酒中。世界卫生组织对饮用水规定甲醛含量不能超过0.9毫克／升。
啤酒生产中主要原料是麦芽,甲醛是大麦浸麦过程中常用的一种添加剂，使用后，甲醛会残留一部分在麦芽，带到啤酒中。
啤酒生产过程中甲醛的产生途径比较复杂，在解决甲醛助剂问题和原料的部分带入以外，啤酒中甲醛仍然存在，原因在于酵母菌利用糖类等物质在发酵过程中也会产生一定甲醛。
（2）甲醛作用
作为添加剂，可杀灭麦皮表面的微生物，具有良好的防腐作用，同时可抵制麦芽根芽的生长，降低制麦损失。
前些时候报导的甲醛风波就是因为部分企业在啤酒制麦的过程中添加了甲醛。啤酒是一种不太稳定的胶体溶液，不容易保持长期稳定，易产生沉淀或混浊，是制麦过程中添加甲醛的原因。啤酒厂家在生产过程中往啤酒里加甲醛，可以通过化学反应，去除多酚，避免絮状沉淀，目的是提高啤酒的卖相。这是生产中添加甲醛最主要的原因。
1.2 啤酒中甲醛引起广泛关注
1.2.1 甲醛危害
甲醛有毒，在我国的《食品安全法》中明确规定不能将它作为食品添加剂使用。现代科学研究表明，甲醛对人体健康有负面影响。当室内空气中含量为0.1mg/m3时就有异味和不适感；0.5mg/m3可刺激眼睛引起流泪；0.6mg/m3时引起咽喉不适或疼痛；浓度再高可引起恶心、呕吐、咳嗽、胸闷、气喘甚至肺气肿；当空气中达到30mg/m3时可当即导致死亡。甲醛对室内生活或工作者的健康影响最敏感的是嗅觉的刺激。通常，人的甲醛嗅觉阈为0.06～0.07毫克每立方米，但个体差异很大，有的人嗅觉阈可高达2.68毫克每立方米。
长期接触低剂量的甲醛会引起慢性呼吸道疾病甚至鼻咽癌。甲醛的危害还表现在它能凝固蛋白质，可使人致癌。高浓度的甲醛对神经系统、免疫系统、肝脏等都有毒害。甲醛还有致畸、致癌作用，据流行病学调查，长期接触甲醛的人，可引起鼻腔、口腔、鼻咽、咽喉、皮肤和消化道的癌症。专家指出，尽管甲醛含量低于每升0.2毫克是安全的，但大量饮用会增加肝的负担，长期饮用还会影响生殖能力。
1.2.2 低甲醛啤酒酵母菌株选育意义
关注酵母菌发酵中产生的甲醛，做到低甲醛发酵，这已经成为啤酒行业研究人员的共识。
 随着生活水平的不断提高，国人对健康越来越重视。虽然甲醛在啤酒中经过分解之后，残留量很低，甚至低到难以检测出来的地步，一般不会对人体造成伤害；但是甲醛对消费者来说还是谈之色变，更有甚者望而却步，使啤酒行业受到了或多或少的置疑。
甲醛问题的关键是如何提高啤酒非生物稳定性的问题。在过去的研究中，人们始终以除去形成啤酒母体混浊物质如蛋白质，多酚类物质为主要内容，至今啤酒行业仍以硅胶或单宁除去蛋白质类物质，吸附多酚、花色苷类物质或以蛋白酶降解蛋白质等以求提高啤酒非生物稳定性。其结果并不令人满意，但蛋白质、多酚类物质作为啤酒有效成份，过多的除去影响啤酒的口感和泡沫，而这些物质又是人体所必需的。这是传统工艺难以解决的。
低甲醛啤酒 的酿造，专家们越来越寄希望于利用生物工程的新手段选育优良酵母菌株的选育上。
1.3 课题主要研究内容和意义
本课题研究内容主要分为三部分：第一部分研究啤酒的酵母生理生化形态和酵母原生质体制备技术；第二部分研究内容将通过不同酵母菌的发酵对比及市售成品啤酒检测甲醛来完成；第三部分研究内容将利用原生质体紫外诱变及再生技术来实现菌株的改良优化，使发酵菌在发酵过程中产生低甲醛或者不产生甲醛，用再生酵母发酵啤酒并检测其甲醛含量，选出产生甲醛含量少的酵母菌株。
本实验拟解决的关键技术是控制原生质体紫外诱变，得到低甲醛或者无甲醛的生产酵母。利用原生质体紫外诱变，对酵母代谢产生甲醛机理加以改造调控，并通过乙酰丙酮分光光度法检测发酵啤酒中甲醛含量挑选优良酵母，这是完成本项目的研究内容的关键技术。
2  实验部分
2.1 实验材料
2.1.1 菌种
啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiaes) 实验室保藏。
2.1.2 培养基
（1） 液体YEPD培养基：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml，调PH6.0；
（2） 固体YEPD培养基：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml，另加琼脂1.2%，调PH6.0；
（3） 固体RYEPD培养基：YEPD培养基中添加10%蔗糖（或0.7mol/L KCl），另加琼脂1.2%；
（4） 麦芽汁培养基：粉碎125g麦芽加入600ml水，置于温度为65℃水浴锅内，处理至吸取混合液滴加碘液不显蓝色则糖化完全用四层纱布过滤混合液，收集滤液；
2.1.3 主要仪器设备
表2-1　主要仪器设备、型号及厂家
仪器名称 型号 厂家
单人单面净化工作台
霉菌培养箱
落地冷冻摇床
座式自动电热压力蒸汽灭菌锅
低速大容量多管离心机
电子分析天平Ⅱ
双目生物显微镜
紫外可见分光光度计
药材粉碎机 SW-CJ-1B
MJX-160B-Z
HZ-9310K
ZDX-35BI
LXJ-ⅡB
JA1003
YS100
UV-7504C
QE-02A 苏州净化设备有限公司
上海博迅是实业有限公司医疗设备厂
华利达实验设备公司太仓市科教器材厂
上海申安医疗器械厂
上海安亭科学仪器厂
上海上平仪器公司
南京江南光电新兴光学仪器有限公司
上海第三分析仪器厂
武义县屹立工具有限公司
（1）水蒸汽蒸馏装置：500mL三口烧瓶×2个、30cm玻璃直管×2、玻璃弯管×2、三通、温度计、直型冷凝管、75°玻璃弯管、250mL锥形瓶，橡皮管，等；
（2）其他：酒精灯，接种针，血球记数板，载玻片，盖玻片，三角烧瓶，烧杯，量筒，等。
2.1.4 主要药品
表2-2 主要药品、规格及出厂
药品名称   规格 出厂
酵母粉
蛋白胨
纤维素酶
蜗牛酶
蔗糖
葡萄糖
琼脂
乙酰丙酮
乙酸胺
乙酸
甲醛 BC
BC
BC
BC
AR
AR
BC
AR
AR
AR
AR 富阳市杭富生物制药厂
南通东海龙生生物制品有限公司
上海伯奥生物科技有限公司
北京百泰生化技术公司
广东光华化学厂有限公司
广东光华化学厂有限公司
福建泉州市泉港化工厂
上海凌峰化学试剂有限公司
广东汕头市西陇化工厂
浙江中星化工试剂有限公司
杭州高晶精细化工有限公司
2.1.5 主要试剂
（1）破壁酶：蜗牛酶固体用0.7mol/L蔗糖溶液配成2.5%浓度；
（2）乙酰丙酮溶液：称取0.4g新蒸馏乙酰丙酮和25g乙酸铵、3mL乙酸溶于水中，定容至200mL备用（用时配制）；
（3）lμg/mL的甲醛标准溶液：称取2.359g 36%的甲醛稀释至500mL；
（4）200 g/L 磷酸溶液：称取50g磷酸稀释至250mL；
2.2 实验方法
2.2.1 啤酒酵母活化
 接保藏菌种于固体YEPD培养基斜面培养箱30℃活化36h以上；
2.2.2 对数期啤酒酵母培养
  挑取活化菌种于15mL YEPD液体培养基摇床30℃ 180 r/min 培养16h；

2.2.3 原生质体制备
（1）菌体收集
挑取活化菌种于15mL YEPD液体培养基摇床30℃ 180 r/min 培养16h；得到对数生长期的液体菌种，4000r/min 离心5min，弃上清夜，收集菌体，用蔗糖缓冲液洗涤二次。
（2）细胞破壁
用2.5%的蜗牛酶液悬浮菌体，在30℃恒温水浴处理3h；显微镜镜检酶脱壁效果。
（3）原生质体收集
将破壁的混合液用5层擦镜纸过滤，得到的滤液1000r/min 离心3min，取上清液；再将上清液3000r/min 离心10min，得原生质体沉淀。
2.2.4 原生质体观察
用0.7mol/L的蔗糖缓冲液稀释原生质体沉淀10倍，吸取一滴于血球计数板上，显微镜下观察计数。
2.2.5 原生质体再生率
将15mL YEPD液体培养基制得的原生质体沉淀用0.7mol/L的蔗糖缓冲液稀释50倍，吸取稀释液1ml于90mm的培养皿中，稀释液与RYEPD固体培养基混合，倒入90mm培养皿中， 30℃培养3d，计算单菌落数（记为C）；吸取稀释液1ml于90mm的培养皿中，稀释液与YEPD固体培养基混合，倒入90mm培养皿中， 30℃培养3d，计算单菌落数（记为B）；将15mL YEPD液体培养基离心得到的菌体用0.7mol/L的蔗糖缓冲液稀释50倍，吸取稀释液1ml于90mm的培养皿中，稀释液与YEPD固体培养基混合，倒入90mm培养皿中， 30℃培养3d，计算单菌落数（记为A）；
形成率＝（A-B）/A×100%
再生率＝（C-B）/（A-B）×100%
2.2.6 原生质体诱变
将原生质体用0.7mol/L的蔗糖缓冲液稀释10倍，吸取稀释液1ml于90mm的培养皿中，在距紫外灯30cm处照射2min；在暗处把诱变的稀释液与RYEPD固体培养基混合，倒入90mm培养皿中，避光30℃培养2d，挑选单个菌落，在YEPD固体培养基上划线培养分离得到纯菌落；
2.2.7 麦芽汁制备
（1）粉碎：称取125g大麦芽（西湖啤酒厂提供），粉碎成约粗细颗粒比为2.5：1的粉末，加入1000mL的水；
（2）酸休止：将装混合液的烧杯放入37℃恒温水浴锅内，搅拌加热30min；
（3）蛋白休止：水浴锅温度升高至52℃，搅拌加热混合液1h；
（4）糖化分解：水浴锅温度升高至65℃，处理至吸取混合液滴加碘液不显蓝色则糖化完全；
（5）糖化终了：把水温升高至76-78℃静置10min；
（6）冷却过滤：用四层纱布过滤混合液，收集滤液；
（7）麦芽汁煮沸：加热滤液至沸腾，加入酒花（西湖啤酒厂提供）总量（2.4g/1000mL）的20%，当煮沸40min后，添加酒花总量的40%，煮沸90min后，加入剩余的酒花，并补足水；
（8）冷却过滤：冷却至4℃沉淀30min后，用脱脂棉过滤；
2.2.8 啤酒酵母发酵
（1） 菌体活化
接保藏菌种于固体YEPD培养基斜面培养箱30℃活化36h以上；
（2）培养基
种子扩大培养基：3瓶15mL麦芽汁培养基 与3瓶15mL YEPD液体培养基做平行与对照实验；
啤酒酿造培养基：3瓶200mL麦芽汁培养基与3瓶200mL YEPD液体培养基做平行与对照实验；
（3） 酿造参数
种子培养　挑取活化菌种于15mL YEPD液体培养基摇床30℃ 180 r/min 培养16h；
前发酵　200mL YEPD液体培养基摇床12℃，180 r/min 培养1d ；10℃ 180 r/min 培养2d ；8℃ 180 r/min 培养1d ；
后发酵　200mL YEPD液体培养基4 ℃ 无氧培养10d；
（4）离心去酵母泥
啤酒发酵完成后，将发酵醪液于4000r/min 离心5min，弃沉淀，得到成品生啤酒。

2.2.9 甲醛测定
乙酰丙酮分光光度法（发酵酒卫生标准分析方法GB/T 5009.49--2003）
（1）原理
甲醛在过量乙酸胺的存在下，与乙酰丙酮和氨离子生成黄色的3,5-二乙酰基-1,4-二氢吡啶化合物。在波长415nm 处有最大吸收，颜色的深浅与甲醛的含量成正比，相应可得出试样中甲醛的含量。
（2）试剂准备
25mL啤酒反复倾倒除去CO2；
（3）流程
① 制作标准曲线
精密吸取0.00 、0.50 、1.00 、2.00、3.00 、4.00、8.00 mL ，l μg/mL的甲醛标准溶液于25mL比色管中，加水至10mL；各加入2mL乙酰丙酮溶液，摇匀后在沸水浴中加热10 min ，取出冷却，于分光光度计波长420nm 处测定吸光度，绘制标准曲线。
②试样处理
吸取已除去CO2的啤酒25mL 移入500mL 蒸馏瓶中，加20mL 200 g/L 磷酸溶液于蒸馏瓶，接水蒸气蒸馏装置中蒸馏，收集馏出液于100mL容量瓶中（约100mL）冷却后加水稀释至刻度。加入2mL乙酰丙酮溶液，摇匀后在沸水浴中加热10 min ，取出冷却，于分光光度计波长420nm 处测定吸光度，从标准曲线上查出试样的含量。
(4) 结果计算
X ＝ A / V
式中：
X ― 试样中甲醛的含量，单位为毫克每升（mg/L）；
A ― 从标准曲线上查出的相当的甲醛的质量，单位为微克（μg）；
V ― 测定样液中相当的试样体积，单位为毫升（mL）。
3  结果与讨论

3.1 影响原生质体形成因素
在原生质体制备过程中，在破坏细胞壁的同时，不能影响到细胞膜的完整性，更不能使细胞内部结构受到破坏，为此只能选用对细胞壁有专一性作用的酶。蜗牛酶是一种混合酶，它含有纤维素酶，果胶酶，淀粉酶，蛋白酶等20多种酶，用于啤酒酵母细胞壁的降解有较好的效果。
3.1.1 酶解温度的影响
不同酶具有各自不同的最适温度，这在水解细胞壁时首先要考虑的。同时还要注意原生质体存活的最适温度，以避免因温度不当而导致原生质体活性降低，甚至被破坏。
表3-1　酶作用温度的影响＊
温 度（℃） 25 30 35
菌体数目（个）
原生质体数目（个）
生成率（%） 4.5×107
3.8×107
84.4 4.7×107
4.21×107
89.6 4.1×107
3.23×107
78.9
注*：酶浓度为2.5%,时间180min
3.1.2 酶解时间的影响
一般来说，原生质体形成率随着时间的增加而增加，但是由于在生产实践中，发酵周期的增加对于资金流动不利，增加了企业的负担、降低了设备的利用率。这些对生产都是不利的，我们要综合考虑形成率和时间之间的关系。
表3-2　酶解时间的影响＊
时间（min） 150 180 210
菌体数目（个）
原生质体数目（个）
生成率（%） 4.6×107
3.74×107
81.3 4.3×107
3.68×107
85.6 4.2×107
3.62×107
86.2
注*：酶浓度为2.5%
3.1.3 显微镜镜检原生质体
 
图1  原生质体（×４０）            图2  原生质体滴加酒精（×４０）
3.2 紫外诱变剂量的选择
    由于致死率不能过高或过低，过低诱变效果不佳；过高则负变菌株增多，且总体存活菌株太少而无从选择，因此诱变时间对原生质体的再生有很大的影响。从表3-3中可以看出，随着照射时间的增长，致死率也增加了，因此选用照射时间为120s对原生质体进行诱变处理。
表3-3　诱变时间与致死率的关系
诱变时间(s) 20 40 60 120 180 240
诱变前数目（个）
诱变后数目（个）
致死率（%）
再生率（%） 4.5×107
3.9×107
13.3
13.9 4.3×107
2.2×107
48.8
10.3 4.3×107
5.6×106
87.0
5.6 4.4×107
8.6×105
98.0
1.3 4.4×107
8.8×105
98.0
0 4.3×107
0
100
0
3.3 啤酒发酵
(1) 种子培养：挑取菌种于15mL YEPD液体培养基摇床30℃ 180 r/min 培养16h；
(2) 前发酵：前发酵：200mL YEPD液体培养基摇床12℃  180 r/min 培养1d ；10℃  180 r/min 培养2d ；8℃  180 r/min 培养1d ；
(3) 后发酵：200mL YEPD液体培养基4 ℃ 无氧培养；
(4) 结果
 
图3 不同培养基啤酒发酵前后对照
左起顺序为：YEPD、YEPD(接种)、麦牙汁、麦牙汁（接种）
 
图4 不同菌种啤酒发酵对照
左起顺序为：水、诱1、诱2、西湖、诱3、诱4、诱5

3.4 甲醛含量测定
3.4.1 甲醛标准曲线
   于分光光度计波长420nm 处测定吸光度，绘制标准曲线图5。
 
图5 甲醛标准曲线
注：X ＝ A/V
式中，
X ― 试样中甲醛的含量，单位为毫克每升（mg/L）；
A ― 从标准曲线上查出的相当的甲醛的质量，单位为微克（μg）；
V ― 测定样液中相当的试样体积，单位为毫升（mL）。
3.4.2 酿造用水及初始麦芽汁甲醛测定
表3-4　酿造用水及初始麦芽汁甲醛测定
序号 项目 420nm 吸光度（A） 甲醛含量（mg/L）
1
2 水
麦芽汁 0.013
0.064 0.072
0.533
3.4.3 发酵醪液中甲醛测定
实验室原保存酵母（原）、酵母原生质体紫外诱变再生菌种（诱）经发酵所得啤酒，市场购得西湖啤酒9°p（西）测定甲醛含量。
前发酵：200mL YEPD液体培养基摇床12℃  180 r/min 培养1d ；10℃  180 r/min 培养2d ；8℃  180 r/min 培养1d ；后发酵：200mL YEPD液体培养基4 ℃ 无氧培养。
（1） 发酵第10d测定甲醛含量
表3-5　后发酵第10d甲醛测定
序号 项目 420nm 吸光度（A） 甲醛含量（mg/L）
1
2
3
4
5
6 原
诱1
诱2
诱3
诱4
西 0.054
0.080
0.057
0.058
0.058
0.075 0.443
0.678
0.470
0.479
0.479
0.632
（2）发酵第11d测定甲醛含量
表3-6　后发酵第11d甲醛测定
序号  项目 420nm 吸光度（A） 甲醛含量（mg/L）
1
2
3
4
5
6 原
诱1
诱2
诱3
诱4
西 0.055
0.061
0.054
0.048
0.046
0.072 0.452
0.506
0.443
0.388
0.370
0.605
（3） 发酵第13d测定甲醛含量
表 3-7　后发酵第13d甲醛测定
序号 项目 420nm 吸光度（A） 甲醛含量（mg/L）
1
2
3
4
5
6 原
诱1
诱2
诱3
诱4
西 0.038
0.040
0.037
0.034
0.033
0.073 0.298
0.316
0.289
0.262
0.252
0.614

（4）发酵第15d测定甲醛含量
表3-8　后发酵第15d甲醛测定
序号 项目 420nm 吸光度（A） 甲醛含量（mg/L）
1
2
3
4
5
6 原
诱1
诱2
诱3
诱4
西 0.030
0.031
0.032
0.031
0.034
0.069 0.226
0.235
0.244
0.234
0.262
0.578
3.5 实验讨论
初探证明生长对数期的啤酒酵母在2.5%的蜗牛酶，30℃下水解180min效率最高（见表3-1，表3-2），经此方法制备原生质体得率接近90%，保证了诱变再生环节中的材料为原生质体。
由于原生质体致死率不能过高或过低，过低诱变效果不佳，过高则负变菌株增多，且总体存活菌株太少而无从选择，因此诱变时间对原生质体的再生有很大的影响。考虑到致死率和正、负向突变的概率，本实验选用照射时间为120s（见表3-3）对原生质体进行诱变处理。
经本实验可以得出，酿造用水有部分甲醛存在；由麦芽汁制备过程中（不人为添加甲醛）的美拉德反应占大部分；发酵过程中也产生一部分的甲醛，但是随着后发酵时间的增加，甲醛含量不断减少。
4  总结与展望
4.1 总结
经过了整个实验操作，基本熟悉了啤酒酵母原生质体的生理特性，制备技术以及啤酒酿造过程中应注意的事项等。啤酒酵母的性能深深地影响着啤酒的发酵，可以说是啤酒的生命。改造啤酒酵母就是从源头上改造啤酒，在市场竞争上取有利的地位。
啤酒酵母的生理状态是决定原生质体产量的主要因素之一，特别是菌龄，明显的影响酵母菌体的发酵生产和原生质体的释放。原生质体由于没有了细胞壁的保护作用，极易受到外界环境因素的影响，尤其是对渗透压。稳定剂不仅能防止原生质体的破裂，控制并达到最大的数量，而且对提高酶的活性，促进酶和底物的结合都具有相当的优越性。这些都是酶解的预处理，对后面的原生质体的形成有很重要的作用。因为原生质体对环境的敏感，使其容易被诱变，融合，这是原生质体育种兴起的根本原因，但是我们必须注意在原生质体制备过程中，实验操作的严谨性，使原生质体保持完整，不受外界因素的破坏。
不同的酶具有各自不同的最适温度，这是在水解细胞壁是要首先考虑的。同时还要注意菌株生长最适温度，以避免因温度不当导致原生质体活性降低，甚至被破坏，这就是本次实验研究的生产意义之一。要确定酶解温度是要对以上两种因素综合考虑，两方面要兼顾到。一般来说，酵母的酶解温度是细菌、放线菌、真菌中是最低的。一般来说，原生质体形成率随着时间的增加而增加，但是由于在生产实践中，发酵周期的增加对于资金流动不利，增加了企业的负担、降低了设备的利用率。这些对生产都是不利的，我们要综合考虑形成率和时间之间的关系。经本实验研究得出生长对数期的啤酒酵母在2.5%的蜗牛酶，30℃下水解180min效率最高。
对原生质体进行改造，利用原生质体的各种优良实验品质来选育优良的发酵种子，是本次实验的灵魂，体现了生物工程在新时期的工作方法。由于原生质体致死率不能过高或过低，过低诱变效果不佳，过高则负变菌株增多，且总体存活菌株太少而无从选择，因此诱变时间对原生质体的再生有很大的影响。考虑到致死率和正、负向突变的概率，本实验选用照射时间为120s对原生质体进行诱变处理。再挑取单菌落进行啤酒发酵，进一步检测其甲醛含量。然此步骤简单，操作繁琐。
本实验采用乙酰丙酮分光光度法（发酵酒卫生标准分析方法GB/T 5009.49--2003）来分析发酵醪液中的甲醛含量，但是标准中并没有切实规定水蒸气蒸馏装置要求，及过程中水蒸气的流量等，加大了实验的人为误差。
4.2 展望
啤酒因其富含多种氨基酸和微量元素，已成为社会各类消费者广为接受的健康营养和佐餐食品。06年全国啤酒总产量将超过3000万吨，已连续多年超过美国，稳居世界第一, 05年浙江省啤酒生产以200多万吨的产量居国内啤酒业“老二”位置。目前浙江啤酒工业已形成了近50家企业，在全国的啤酒生产中占有举足轻重的地位。
啤酒工业在国内是一门年轻的工业，只有七十多年的历史。为了适应四个现代化的需要，我们必须总结国内的经验，引进和采用国外的先进技术，使国内啤酒工业能够跟上形式所需，在国际立于不败地位。所以我国的啤酒行业还有我辈大有可为之处。
随着国民生活水平的提高，对健康的重视提到了更高的高度，甲醛风波便是例证。原生质体育种技术的进展，使得发酵工程的得到了更大的发展。通过原生质体育种，不仅可以提高目的物的产量，是目的物的产量上百倍上千倍的提高，大大降低了生产的成本，提高了经济效益，还可以简化工艺，减少副产物，提高产品质量，改变有效成分组成，甚至获得更高的新成分，而且与传统的育种方法相比也更具有优势。
但是菌种诱变过程中的不定向，给实验带来的不可知数很大；菌种诱变再生后的选择过程繁琐，化繁为简当是以后的工作方向。种子改良是生物工程的研究内容，或许可以试验一种选择性培养基或者鉴别培养基，不用通过提取分析发酵醪液，还有很大的改善空间。
致   谢
在整个实验过程中，本人花较长的时间一直寻找资料，参考了大量书籍，期刊等资料，由于酵母在微生物研究中的重要作用，以及现代发酵工业中的普遍应用，前人已在这个领域作了很多工作，给我的实验方案的形成，以及具体的操作带来了很大的帮助，本文在参考文献上有详细记载，在此不一一谢过。
感谢指导老师刘士旺博士帮助建立本实验方案，并帮助制定实验进度安排，使后期的操作过程中不至于中途彷徨而迷失前进的方向，作到了决胜于千里之外。感谢陈江同学在原生质体制备过程中提供帮助，各位同门在具体操作中提供的帮助。
虽然充分考虑到了实验过程中困难以及失败，但是不免因此而沮丧、失落，感谢指导老师刘士旺博士帮助及时纠正错误与调整研究方法，解决各种困惑。
感谢我的家人以及同学在精神和物质上的帮助，实验的进度和各位的关心帮助是分不开的。
再次感谢我的指导老师刘士旺博士，感谢陈江同学以及家人、同门、朋友。
参考文献
[1] 曹晓霞,金玉来,马进.甲醛在制麦工艺中的应用[J].大麦科学, 2000 (1):45-48
[2] 郑金成,郑翔鹏.啤酒生产糖化 中甲醛替代品的研究探讨[J].酿酒科技, 2002 (5):56-58
[3] 孙桂丽,赵虹,张洁.啤酒中甲醛测定方法的选择和改进[J].预防医学情报杂志,2005,21(2): 246-248
[4] 李红,张五九.甲醛含量测定方法的研究[J].技术研究,2006(4):38-43
[5] 王圣庆,郭瑛,马元顺,等.柱前衍生高效液相色谱法测定啤酒中微量甲醛[J].化学研究与应用,2006, 18(2):214-216
[6] 罗伟,郑翔鹏.无添加甲醛酿造啤酒工艺的研究[J].福建轻纺,2003(10):15-22
[7] 康明官,唐是雯.啤酒酿造[M].北京:轻工业出版社,1990
[8] 陈海昌,唐屹,张岭花.原生质体融合技术提高啤酒酵母凝絮性的研究[J].微生物学通报, 1994, 24(4):213-217
[9]  Aparicio OM. Veinstein ents and dynamics of DNA replication complexes in S．Cerevisiae：Redistribution of M CM proteins and Cdc45p during S phase. Cell,1997, 91:59-69.
. Cell Research, 2001,11(4): 285-291.
[11]丁朋晓,杨季芳,谢和.原生质体融合技术及其在微生物遗传育种上的应用[J].贵州农业科学,2007 ,35 (3) :139-141
[12]谭文辉,李燕萍,许杨.微生物原生质体制备及再生的影响因素[J ].现代食品科技,2006 , 22 (3) :26-32
[13]陈海昌,唐屹,张岭花,等.原生质体融合技术提高啤酒酵母凝絮性的研究[J ].微生物学通报,1994 ,21 (4) :21322171
[14]聂明,李怀波,万佳蓉. 工业微生物遗传育种的研究进展 [J ].现代食品科技,2005 ,21 (3) 18421871
[15]谭文辉,李燕萍,许杨. 微生物原生质体制备及再生的影响因素[J ].现代食品科技,2006 ,22 (3) :26322651
[16]王正祥,诸葛健.杀伤啤酒酵母的构建及其发酵性能研究[J].食品与发酵工业,1991,4(1):1-6
[17]申彤.果酒酵母的选育研究进展[J].酿酒,2005,32(1):43-44