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PTEN与Bcl2在鼻咽癌中的表达

发布时间:2015-07-06 12:35

【摘要】 目的观察pten与bcl2在鼻咽癌(npc)中的表达情况,探讨两者的表达及其联合表达在npc发生、发展、侵袭和转移过程中的可能作用。方法采用免疫组织化学染色法,观察50例npc 石蜡标本和15例正常鼻咽黏膜标本中pten与bcl2的蛋白表达情况。结果正常鼻咽组织中,pten呈强阳性表达,而bcl2的表达仅局限在上皮层的基底细胞层。npc中,pten阳性表达率为22.0%(11/50),bcl2为82.0%(41/50),与正常组比较,差异均有统计学意义。两者在npc的表达强度无明显相关(r=-0.109,p=0.453)。结论在npc组织中,pten的低表达或表达缺失和bcl2强阳性表达可能协同参与了npc的发生,而在npc的发展、浸润和转移过程中,两者未能表现出明显的相关性。

【关键词】 pten;滤泡型b细胞淋巴瘤/白血病2;鼻咽癌

expression and clinical significance of pten and bcl2 in nasopharyngeal carcinoma tissue

liu yangyun1, liu gengxun2,li zhengxian1,sun zhengliang1,zhou guanghua1,jiang wen1

1.department of otolaryngology, the second affiliated hospital of hu′nan normal university(no. 163 hospital of pla),changsha 410003, china ,2.department of pathology abstract:objective to investigate the expression and interrelationship of phospharase and tensill homolog deleted on chromosome ten(pten) and bcell lymphoma/leukemia2(bcl2) in npc. to evaluate their clinical implications in carcinogenesis, development, invasion and metastasis of npc.methodsthe expression of pten and bcl2 was examined in 50 poorly differentiated npc samples and 15 normal nasopharyngeal epithelium tissues using immunohistochemical staining (sp method).resultsin 15 normal nasopharyngeal epithelium samples pten was highly expressed but bcl2 protein expression was limited to the basal cell layer. the positive rates of pten and bcl2 protein expressions were 22%(11/50), 82%(41/50) in npc tissues, respectively. the differences between the npc and normal nasopharyngeal epithelium in both pten and bcl2 expressions were significantly observed according to the statistical analysis results . pten but not bcl2 expression was associated with t stage, lymph nodes metastases. there was no correlation between pten and bcl2 expressions in npc tissues.conclusionreduced or absent expression of pten and high expression of bcl2 were observed in npc tissues, which implied their mutual cooperative role to participate in tumor occurrence , progression and metastasis of npc.

key words:phospharase and tensill homolog deleted on chromosome ten(pten), bcell lymphoma/leukemia2(bcl2), nasopharyngeal carcinoma(npc)

1资料与方法

1.1标本来源收集解放军163中心医院2000年1月~2006年12月65例鼻咽活检石蜡标本,其中低分化鳞癌50例,均经病理证实。www.lw881.com男女各25例,年龄16~78岁,中位年龄46岁。tnm分期采用2003年修改的国际抗癌联盟(uicc)和美国肿瘤联合会(ajcc)联合制定的tnm分期法分为t1:5例,t2:9例,t3:26例,t4:10例;有淋巴结转移者35例,无淋巴结转移者15例。所有病例活检前均未接受抗癌治疗。另取同期15例病理证实为慢性炎症的鼻咽黏膜标本作对照,男9例,女6例,年龄20~73岁,中位年龄47岁。

1.2主要试剂 pten、bcl2、即用型免疫组织化学超敏ultrasensitivetmsp试剂盒、酶底物显色剂dab kit(×20)、内源性生物素阻断试剂盒ihc biotin block kit、edta抗原修复缓冲液(×50) (ph8.0)均购自福州迈新生物技术有限公司,均为迈新即用型产品。

1.3方法

1.3.1免疫组化检测 pten和bcl2染色按sp染色试剂盒说明书操作。一抗工作浓度为1∶100。pten以喉癌组织作为阳性对照,bcl2以乳腺癌组织作为阳性对照,均以pbs代替一抗作阴性对照。

1.3.2结果判定标准 npc组织中,细胞胞质和胞核出现棕黄色颗粒状为pten阳性;细胞膜或核膜上出现黄色颗粒或斑片为bcl2阳性。参照文献资料[12],结果评分采用双盲法,在光学显微镜下观察,随机取5个视野(×400),计数每个视野下阳性细胞数,计算阳性细胞百分比(1)阳性细胞百分比:无阳性细胞为0分,阳性细胞≤10%为1分,11%~50%为2分,51%~75%为3分,76%~100%为4分。(2)阳性细胞染色强弱:阴性为无色0分、1分为淡黄色、2分为棕黄色、3分为棕褐色。(1)(2)两项的乘积即为该视野下的免疫组化评分,选取5个视野计算平均分。0~1分为(-);2~4分(+);5~7分(++);≥8分(+++)。

1.3.3统计学方法所有数据均用spss10.0统计程序包进行统计学分析。pten和bcl2在各组之间阳性表达率的差异采用fisher确切概率法检验;两者表达强度之间的相关性用spearman相关分析。p<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1正常鼻咽黏膜和npc组织中pten和bcl2的表达15例正常鼻咽黏膜组织pten蛋白均表达强阳性,而bcl2表达仅局限于基底细胞层,见图1~8。50例低分化npc组织中,pten表达阳性11例,阴性39例(78.0%,χ2=29.250,p=0.000)。bcl2表达阳性41例(82.0%,χ2=23.924,p=0.000)。

2.2pten和 bcl2的表达与临床特征的关系

不同的t分期及有无淋巴结转移之间,pten阳性表达率差异具有统计学意义,其阳性表达为t1 3例,t2 5例,t3 3例,t4 0例,t1与t2 (χ2=0.026,p=1.000)、t3与t4(χ2=1.259,p=0.545)间阳性表达率差异无统计学意义,t1与t3 (χ2=6.310,p=0.038)、t1与t4(χ2=7.500,p=0.022) 及t2与t3 (χ2=7.346,p=0.015)、t2与t4(χ2=7.540,p=0.011)间阳性表达率差异有统计学意义。图1pten在正常鼻咽黏膜中表达强阳性(sp×400)图2pten在鼻咽癌组织中弱阳性表达(sp×400)

  2.3npc组织中pten与bcl2的联合表达两者共同表达阳性8例,共同表达阴性6例,pten阳性而bcl2阴性3例,pten阴性而bcl2阳性33例。39例pten ()中,bcl2表达 、+、++、+++者分别为6、7、6、20例;5例pten (+)中,bcl2表达、+++者分别为1、4例;4例pten (++)中,bcl2表达+、++、+++者分别为1、2、1例;2例pten(+++)中,bcl2 ( )2例。作spearman 相关分析,相关系数r=-0.109,p=0.453,表明pten与bcl2在npc中的表达强度无明显相关。

3讨论

  抑癌基因pten位于染色体10q23.3,全长200kb,含9个外显子和8个内含子。pten的抑癌作用主要体现在诱导细胞周期停止和程序性细胞死亡,调节细胞的粘连、移动和分化,抑制血管的生成[3]。pten通过pi3k/akt依赖性和非依赖性途径调节细胞生长的整个过程。pten基因调节的pi3k/akt信号途径是一个独立于其他通路的新的生长因子信号传导系统,参与调控细胞的代谢、生长、凋亡、恶变等肿瘤生物学特性[4]。pten基因的突变或缺失导致磷酸酶活性丧失,失去了对细胞增殖的负调控作用,诱导细胞持续增殖,使细胞发生恶性转化,促进了肿瘤的形成。研究发现,pten基因的突变和纯合性丢失见于多种原发性恶性肿瘤,直肠癌中pten蛋白的表达降低或缺失,赋予了癌细胞比较强的侵袭和转移潜能,参与了结直肠癌的侵袭和转移过程[5]。pten在鼻咽癌的发生及发展过程中有表达缺失,且与病理类型、病理分级、临床分期有关[6]。本研究中,正常鼻咽黏膜组pten蛋白表达阳性率明显高于鼻咽癌组,说明pten的低表达与npc的发生相关。同时t1与t2、t3与t4组间阳性表达率差异无统计学意义,t1与t3、t1与t4及t2与t3、t2与t4组间阳性表达率差异有统计学意义,t3~4组pten蛋白表达阳性率明显低于t1~2组,说明了pten的缺失促进了npc细胞的生长。有淋巴结转移组pten蛋白表达阳性率明显低于无淋巴结转移组,表明pten与npc的转移呈负相关。bcl2基因表达的改变不仅影响dna损伤细胞或周期异常细胞的正常凋亡,还影响肿瘤细胞自身的凋亡。尽管bcl2基因家族成员众多,但目前发现与鼻咽癌密切相关的只有四个[7]:bcl2基因、bax基因、bclx基因、eb病毒基因。bcl2基因编码分子量为25~26kd蛋白质,bcl2蛋白位于核膜粗面内质网膜和线粒体膜上,它主要通过稳定线粒体膜电位,阻止细胞色素c和凋亡抑制因子的释放,阻断caspase酶活化的上游信号传递通路等作用,抑制细胞凋亡的发生,最终导致细胞恶变[8]。正常鼻咽黏膜中,bcl2蛋白主要分布在上皮层的基底细胞层。本研究15例正常鼻咽黏膜组织中,均检测到了bcl2的表达,但均局限在上皮层的基底细胞层。这说明bcl2对于维持鼻咽黏膜上皮细胞分化、生长具有重要意义。bcl2在npc组织中呈高表达[9],本研究npc组织中bcl2蛋白阳性表达率高达82%,且阳性细胞数目多,高者达100%,与正常鼻咽黏膜比较,差异有统计学意义,这说明bcl2蛋白与鼻咽癌的发生相关,可能bcl2基因通过抑制细胞凋亡、延长细胞寿命、增加细胞其他基因突变机会或使已有基因异常改变的细胞逃避凋亡,参与肿瘤的形成[10]。在npc组织中,bcl2的过表达均表现为强阳性,不同的t分期及有无淋巴结转移之间、不同年龄与性别之间bcl2的阳性表达率及表达强度差异均无统计学意义。这说明正常鼻咽黏膜一旦癌变,bcl2的过表达即维持在一个较高的水平。因此可以认为在npc中,bcl2通过抑制已发生转化的细胞凋亡,使其获得进一步积累突变和基因异常的机会,从而在npc发生过程的早期阶段发挥作用,而一旦转化细胞获得恶性表型,bcl2似乎不再起主要作用[11]。本研究的发现与前面提到的两种观点[12]都不尽一致,由于pten的低表达或表达缺失和bcl2强阳性表达在正常黏膜和npc组织中的差异具有统计学意义,因此,我们认为在npc中,pten的低表达与bcl2的高表达在npc的发生中起作用,两者协同参与了npc的发生,这是由于pten基因可明显抑制细胞bcl2蛋白的表达[12],pten缺失,导致bcl2过表达,共同参与肿瘤的形成。是pten而不是bcl2与npc的t分期及有无淋巴结转移有关,而两者在npc的发展、浸润和转移过程中,未能表现出明显的相关性,其可能机制如下:信号分子3,4,5三磷酸肌醇酯(pip3)是细胞生长主要调节通路的关键因素之一,它同时具有刺激细胞生长和阻止细胞凋亡双重作用。去磷酸化的凋亡前因子bad(也称bclxl/bcl2相关死亡促进子,bclxl/bcl2 associated death promoter)能够与bcl2家族另一成员bclxl形成异源二聚体,从而有利于bax形成同源二聚体,促进细胞凋亡。丝苏氨酸激酶(akt)作为一个已知的原癌蛋白能提高细胞的存活并起到抗凋亡的作用,它通过抑制细胞色素c从线粒体中释放,灭活叉头转录因子fkhr,灭活凋亡前因子bad和caspase9而发挥抗凋亡的活性[13]。pten可以去磷酸化pip3,拮抗pi3k的活性,降低细胞内pip3的浓度,从而抑制akt的激活及其下游激酶的活性,从而导致细胞增殖抑制和细胞凋亡[14]。可见抑癌基因pten缺失后,pip3将刺激细胞生长和阻止细胞凋亡。而bcl2保护发生基因突变的细胞长期生存而不凋亡,但对细胞的增殖无影响[15]。这可能说明为什么pten与npc的t分期及有无淋巴结转移有关,而bcl2却与之无明显相关。

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