黄芪注射液对大鼠脊髓缺血再灌注损伤脊髓ICAM

作者：郝阳泉，尚荣安，王小兵，屈强，刘德玉，昝强

【摘要】 目的探讨黄芪注射液对脊髓缺血再灌注损伤的保护治疗作用及其机制。方法采用肾下腹主动脉阻断法,建立脊髓缺血再灌注模型。实验动物随机分3组，即空白组（a），模型组（b），黄芪预处理组（c）。空白组阻断腹主动脉30 min后开放灌注；黄芪注射液治疗组静脉注射黄芪12 ml/kg 30 min后阻断腹主动脉，阻断腹主动脉30 min后开放再灌注。术后进行神经功能评分,观察脊髓标本的病理改变, 免疫组化染色icam-1和hsp70的表达。结果神经功能评分治疗组在各时间点明显高于模型组(p<0.05),组织病理学变化各时间点明显好于模型组, icam-1免疫阳性血管数较模型组减少，hsp70表达显著增加，且有显著差异(p<0.05)。结论黄芪注射液可显著改善大鼠脊髓缺血再灌注引起的后肢神经功能障碍和组织病理学改变，表明黄芪注射液对大鼠脊髓缺血再灌注损伤有明显的保护作用；黄芪注射液降低大鼠脊髓缺血再灌注后缺血脊髓icam-1的表达，显著增加hsp70表达，可能为黄芪注射液保护脊髓缺血再灌注损伤的机制之一。

【关键词】 脊髓损伤；缺血再灌注；黄芪注射液；icam-1； hsp70

脊髓型颈椎病、脊柱骨折、脊髓供血动脉本身疾患、主动脉手术、脊髓内显微外科手术均可引起脊髓缺血再灌注损伤（sciri），有关脊髓缺血的保护研究，多数集中于技术性保护和药物性保护等防护措施，这些措施虽在一定程度上减轻了脊髓缺血损伤引起的神经功能障碍，但均没有稳定的疗效。因此，寻找新的有效防护手段是一项亟待解决的课题。由于物理性预处理的方法技术操作复杂，对患者创伤较大，临床应用受到较大限制，近年来，更多的学者倾向于用药物来模拟这种物理性预处理的保护作用，诱导产生缺血耐受［1，2］。近年来中药防治sciri成为中医药研究的一个重要课题，中药作用的多用途性似乎与神经损伤病理变化的多样性具有针对性效应，具有广阔的应用前景。

　　1 器材

　　1.1 药品与试剂

　　黄芪注射液由成都地奥九泓制药厂提供，批号:国药准字z51021776；icam-1试剂盒、hsp70试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。

　　1.2 动物

　　健康雄性sd大鼠65只，体质量（250±20） g，平均250 g（陕西省中医研究院实验动物中心提供，许可证号：08-45）。

　　2 方法

　　2.1 分组与给药 随机分为3组， a 组：空白组（n=5），只暴露腹主动脉，然后关闭腹腔；b组：模型组（n=30），尾静脉注射等容量生理盐水30 min后阻断腹主动脉，阻断腹主动脉30 min后开放再灌注； c组：黄芪注射液预处理组（n=30） ,尾静脉注射黄芪注射液（12 ml/kg）30 min后阻断腹主动脉，阻断腹主动脉30 min后开放再灌注。神经功能评分：再灌注4，8，12， 24， 48 h及72 h，由一名不了解分组情况的观察者对动物后肢运动神经功能评分。

　　2.2 采用zivin［3］法复制模型实验动物大鼠以2%戊巴比妥钠按照40 mg/kg体质量进行腹腔麻醉后，仰卧位于手术台上，妥善固定，术中烤灯辐射加热，保持直肠温度38℃，腹部剪毛，取腹正中切口，无菌条件下开腹暴露并分离腹主动脉，手术分离腹主动脉至肾动脉水平，在肾动脉起始部远端用无创伤血管夹夹闭腹主动脉，阻断腹主动脉后，股动脉搏动立即消失并且大鼠下肢发绀。缺血30 min后移去血管夹，开始再灌注，检查主动脉及腹腔无明显损伤出血，关闭腹腔，伤口外涂红霉素软膏，即制成脊髓缺血再灌注损伤模型。术后常规青霉素40万单位肌肉注射，2次/d。分笼饲养，给予标准饲料喂养，供给清洁水，自由摄取。室温保持25℃左右，通风良好。

　　2.3 神经功能评分 评估标准：大鼠运动神经功能评分根据faden(1987)8点分级法和behrmann (1993) 5点分级法加以改进［4］。0分：后肢无自发运动，压夹后肢无反应；1分：后肢无自发运动，但夹后肢有嘶叫、逃避等反应；2分：后肢有自发运动，但不能负重站立；3分：能站立但不能行走；4分：能行走，但不能控制踝关节或足，只能靠膝关节或足内侧行走，且不稳定，腹部着地；5分：能行走，前后肢步态协调，后肢负重明显改善，腹部不着地，但数趾拖步；6分：能行走，仅一或二个足趾拖步，快速转弯时稍有不稳；7分：正常步态和行走。

　　2.4 icam-1 和hsp70免疫组化的测定脊髓icam-1免疫组织化学的测定: 将脊髓组织石蜡切片作icam-1 和hsp70免疫组化的测定。具体操作步骤按照说明书进行。图像分析: icam-1着色以胞浆为主，细胞核/浆染成棕黄色为阳性细胞。应用himas-2000多媒体彩色病理图文分析系统，进行图像分析。10倍镜下进行阳性血管观察，40倍镜下进行阳性血管计数。每张切片随机观察5个测试区的阳性血管数，取其均值。

测量hsp70免疫组织化学染色阳性神经细胞数：每张切片在脊髓灰质前角处随机选取5个不重叠视野，对阳性细胞进行二态化图像修正，400 ×高倍镜下用计算机算出每个视野的阳性神经细胞数，取其平均数。

　　2.5 统计学处理统计分析采用spss 13.0统计软件。计量资料以±s表示，采用t检验判定各实验组与相应对照组间差异显著性。p<0.05表示差异有显著性意义。

　　3 结果

　　3.1 动物后肢运动神经功能评分见表1。表1 不同时间点各组动物后肢运动功能评分（略）

　　3.2 he染色（组织病理学变化）a组：神经细胞轮廓清晰，极性存在，核圆，核仁清楚。尼氏体呈网状均匀排列于核周，胞浆均匀深染，整个组织结构完整、清楚，无中性粒细胞浸润，无出血、水肿等异常现象。b组：再灌注4 h可见部分神经细胞肿胀，极性变钝，核偏位，核仁不清，尼氏体呈细尘颗粒状，组织中可见散在中性粒细胞，未见明显出血。再灌注8 h可见神经细胞固缩，核萎缩，结构不清，胞浆中可见空泡变性，组织中可见中性粒细胞浸润。再灌注12 h可见神经元固缩，细胞周围空泡形成，核仁不清，可见灰质出血和中性粒细胞浸润。再灌注24，48 h组织病理学改变进一步加重，灰质区大部分神经元变性坏死，广泛空泡形成，出血灶明显。再灌注72 h可见灰质结构混乱，胶质细胞增生，残存神经元稀疏；c组：再灌注4 h，神经元结构清晰，组织轻度水肿，核仁清晰，组织中无中性粒细胞浸润。再灌注8 h可见神经细胞轻度肿胀，部分神经元核仁不清，组织中有少量中性粒细胞浸润。再灌注12 h各视野可见神经元固缩，细胞周围少量空泡形成，核仁不清，可见少量灰质出血和中性粒细胞浸润。再灌注24，48 h组织病理学改变较b组明显改善，少量神经元变性坏死，空泡形成少，未见明显出血灶。再灌注72 h脊髓灰质结构稍乱，有较多正常神经元。

　　3.3 免疫组化染色icam-1表达 icam-1是血管内皮细胞分泌的细胞间粘附分子，阳性染色见于微血管的内皮细胞，表现为血管壁深染。a组未见阳性血管表达。b组缺血脊髓可见低表达的icam-1免疫阳性血管。1cam-1阳性着色主要局限于缺血区域，分布于缺血周边半暗带区，缺血中心区分布较少。脊髓缺血再灌注4 h后可见少量阳性染色的血管，随再灌注时间延长，再灌注12 h着色血管数增多，其高峰在24 h。再灌注48 h略有降低，再灌注72 h后脊髓icam-1数量进一步减少，仍维持在比较高的水平。c组（黄芪注射液预处理组）在再灌注各时间点icam-1免疫阳性血管数较模型组减少，且有显著差异(p<0.05)。结果见表2。表2 不同时间点各实验组icam-1阳性血管数目（略）

　　3.4 免疫组化染色hsp70表达a组的大鼠脊髓免疫组化染色切片，表现为阴性结果。在低倍光学显微镜下(100×)，仔细寻找才能在脊髓灰质中看到极少数部分细胞浆显示淡黄色的神经元细胞，藏匿在显示为淡蓝色细胞浆和深蓝色细胞核的广泛分布的各类神经细胞中。实际上，并不能确定这些淡黄染色的细胞是否为神经细胞，因为它们可能是特异性染色的结果。在脊髓白质中不能看到阳性的神经胶质细胞。

　　b组再灌注4 h后，即可在脊髓的灰质中主要是前角看到为数不多的hsp70免疫染色阳性的神经细胞，散落在显示为淡蓝色细胞浆和深色细胞核的阴性神经细胞当中。阳性神经细胞细胞核为深蓝色，细胞浆内显示分布不均的淡黄染色，阴性神经细胞数量明显多于阳性神经细胞数。脊髓白质中未发现阳性神经细胞。再灌注8 h后，脊髓灰质内阳性神经细胞数量略有增加，但染色强度没有明显变化，脊髓白质内仍然不能看到明显的阳性神经细胞。再灌注12 h后，脊髓灰质内阳性神经细胞数量进一步增加，但仍然只占有所有神经细胞的少部分，细胞染色强度略有增加，显示为淡棕黄色，脊髓白质内能看到极少的阳性神经胶质细胞。再灌注24 h后，脊髓内阳性神经细胞数量与12 h相近，染色强度没有明显变化。48 h后染色情况基本和手术后8 h相同。72 h后hsp70免疫染色阳性的神经细胞基本接近再灌注4 h后。总的来说，b组hsp70的表达在实验观察的6 h间点比较平稳，12 h至24 h之间，是hsp70表达的高峰。

　　c组再灌注4 h后，即可在脊髓的灰质和白质中看到大量的hsp70免疫染色阳性的神经细胞。在脊髓灰质前角，阳性神经元细胞细胞核显示为棕黄色，细胞浆内显示分布均匀的淡黄染色，脊髓白质中显示为阳性的神经胶质细胞绝对数量并不多，但也占所显示神经细胞的大部分。再灌注8 h后，脊髓灰质内阳性神经细胞数量进一步增加，细胞浆染色强度增加，表现为棕黄色，脊髓白质内的情况同前。再灌注12 h后，脊髓灰质内显示的神经细胞绝大多数表现为阳性，细胞核、细胞浆染色均为深棕黄色。再灌注24 h后的情况同12 h的表现类似。再灌注48 h后，阳性神经细胞数量略有减少，细胞核、细胞浆内的染色程度减轻。再灌注72 h后阳性神经细胞数量进一步减少，细胞核、细胞浆内的染色程度也进一步减轻，但并不低于损伤后4 h。

利用图像分析仪，我们对3组各个时间点的免疫组化染色切片进行了定量的分析，选择脊髓前角进行阳性神经元的计数，每张切片选取5个不同的视野计数后取平均数。统计数据见表3。表3 不同时间点各实验组hsp70阳性细胞数目（略）

　　4 讨论

脊髓缺血再灌注损伤属于脊髓的继发性损伤,中医辨证属气虚血亏、血脉瘀阻， 乃本虚标实之证。其治则应是益气活血，依据治则我们选用治疗痿证的经典方补阳还五汤中的君药黄芪进行研究。已知［5］在脊髓缺血及再灌注时，由于大量的ofr 的产生，自由基与膜结构中的不饱和脂肪酸作用产生过氧化脂质，导致生物膜的破坏。益气药黄芪可减少ck、ldh 的释放， 减轻mda 升高和sod 下降幅度， 升高no 及nos 的活性,具有较强的抗ofr 的作用，减轻再灌注损伤时ofr 的产生及其引发的脂质过氧化导致细胞损伤。

本实验观察发现，黄芪注射液组再灌注后4，8，12，24，48， 72 h及7 d的神经功能评分明显高于模型组；与模型组相比，黄芪注射液组脊髓组织损伤减轻，形态基本正常的前角细胞较多。从而表明黄芪注射液对大鼠脊髓缺血再灌注损伤有明显的保护作用。

与模型组相比，黄芪注射液组缺血脊髓神经细胞icam-1免疫反应明显降低，图像分析结果表明黄芪注射液组icam-1免疫阳性细胞数明显比模型组减少(p<0.05)， hsp70免疫阳性细胞数明显比模型组增多(p<0.05)；而病理组织学观察黄芪注射液组神经细胞缺血性改变明显较轻。而病理组织学观察黄芪注射液组神经细胞缺血性改变明显较轻。icam-1、hsp70阳性细胞比率与病理损伤、神经功能评分的结果有良好的一致性。说明黄芪注射液对脊髓缺血损伤有一定保护作用，然而，黄芪注射液调控icam-1和hsp70表达目前国内外报道较少，其促使icam-1表达减少和增加hsp70表达的机制尚不十分清楚。缺血再灌注所致的炎症反应中，icam－1的产生来源于缺血再灌注损伤后的血管内皮细胞，因此黄芪减少icam的产生，诱导脊髓细胞hsp70合成增加可能与其保护血管内皮细胞，抑制中性粒细胞的积聚、激活有关。

在脊髓损伤早期，元气大伤，组织受损，当以黄芪补气，生血，使气旺血行，祛瘀而不伤正。黄芪注射液对脊髓缺血/再灌注损伤的保护作用可能与其抑制血小板激活、聚集，扩张小动脉，改善微循环，清除自由基，减少脂质氧化，抑制钙超载，降低缺血组织中icam-1、il-1β的表达，增强热休克蛋白70(hsp70)表达等有关。黄芪注射液是一种纯中药制剂，资源广阔，价格低廉，临床应用剂量安全范围宽，无明显副作用，其对缺血/再灌注损伤的保护作用具有显著的应用前景，有待进一步深入的研究。本实验结果为临床治疗脊髓缺血损伤提供了进一步的理论依据。

【参考文献】
　　［1］王建新,梅广林,胡卫东，等.黄芪在肝脏缺血-再灌注损伤中保护作用的研究［j］.南通大学学报,2005，25（3）：161.

　　［2］陈建常,傅 源,卢开相.丹参对止血带致肢体肌损伤保护作用的研究［j］.中华创伤杂志,1994，10(5)∶219.

　　［3］zivin ja, saito ht. reduction of neur ological damage by a peptide segment of the amyloid betapa4 protein precursor in a rabbit spinal cord ischemia model［j］.exp neurol, 1994,129 (1) :112.

　　［4］于泽生，刘忠军，党耕町.脊髓缺血再灌注损伤中运动诱发电位的监测作用［j］.中华外科杂志，1999，37 (10): 617.

　　［5］李忠哲. 缺血再灌注性损伤［j］.创伤骨科论坛，1999，28 (4)：300.