53例多发性骨髓瘤细胞遗传学研究
多发性骨髓瘤（muMPlemye]on，aMM堤多发于中老年人浆细胞异常增生的恶性肿瘤，其发病机制尚不清楚，病程发展及预后差异大，常规化疗不能治愈，生存期从几天至十几年不等。近年来细胞遗传学的发展推动了MM的细胞遗传学研究。有研究认为，几乎所有的MM患者都存在染色体异常，
但由于骨髓中瘤细胞的数量不等，骨髓瘤细胞的增
殖率较低，复杂核型染色体质量较差而难以分析等原因，以常规细胞遗传学方法（CC)检测MM患者克隆性染色体异常的检出率只有20%-50%1]，而分子细胞遗传学的发展，尤其是FSH技术的应用，克服了CC的缺点，提高了染色体异常的检出率，极大地推动了MM的细胞遗传学研究。本研究对53例MM患者进行常规细胞遗传学检测，并采用5种探针对其中20例MM进行FEH分析，研究MM细胞遗传学特点。
材料和方法
研究对象
53例MM为2004年3月至2009年12月在大连医
科大学附属第一医院门诊及住院的患者，其中男29例，女24例，年龄34-81岁，中位年龄60岁。MM的诊断系根据患者的临床表现、细胞形态学或骨髓活检，免疫球蛋白结果，诊断符合〈(血液病诊断及疗效标准》。正常对照组为20例正常人的骨髓标本。
常规细胞遗传学分析
全部病例均采用不加任何刺激剂的骨髓细胞短期培养法，收获前1小时加秋水仙胺（Sgma公司产品）低渗35分钟，固定液（甲醇冰乙酸=3:1)固定3次，细胞悬液制片，R显带姬姆萨染色后进行核型分析。核型描述按照《人类细胞遗传学国际命名体制(BCN2005)》。
荧光原位杂交（FISH)检测探针采用北京金菩嘉医疗科技有限公司的探针试剂盒，包含5种探针表1)其中GLP1嗲1探针检测基因扩增，正常细胞为2个红色（R)言号，阳性细胞为3个或3个以上红色信号（附图A)GLPD13S319探针检测基因缺失，正常细胞为2个红色(R)信号，阳性细胞为1个或无红色信号（附图B)GLPRB1和GLPp3探针均检测基因缺失，正常细胞为2个绿色（G)信号，阳性细胞为1个或无绿色信号（附图Q;GLPGH探针检测易位正常细胞为2个黄色（Y)信号，阳性细胞为1个黄色1个红色1个绿色信号或2个红色2个绿色信号（附图D)
FEH操作步骤R显带后剩余细胞冻存于一20°C冰箱中。临用前用新鲜固定液洗3次，滴片后气干。玻片在预温过的37°C2XSSC中处理1小时，取出梯度乙醇（70%、85%.100%)脱水，气干。玻片在预温过的73°C、70%甲酰胺/2X&SC变性液中变性5分钟，变性后取出梯度乙醇脱水，气干。将按照试剂说明书配好的探针在73°C水浴变性5分钟后立即取出滴加在变性后气干的玻片上，盖上盖玻片，并用玻片胶封好四周，于37C湿盒内杂交6-16小时，快速洗脱样本每个样本加入DAPH及抗萃灭剂（vyi混合液10!上1后,盖上盖玻片，于暗室中复染30-60分钟。
采集在DAPI/FTC/TRTC3色滤光镜激发下的间期细胞荧光信号，并用CANON全自动数码照相机照相，图像传输入计算机处理。每例标本每种探针分析200-500个间期细胞，计算阳性率。
统计学处理
FHH数据用X±3?表示，经SPSS1Q0统计软件分析。20例正常人骨髓标本经FSH分析得出正常值范围（X±393)(表2)所有病例阳性率以大于正常值上限（X+33))为阳性诊断标准。
结果
常规细胞遗传学分析
正常对照组20例正常人骨髓染色体核型分析均正常。
患者组对53例MM患者染色体核型分析显示，32.1%(17/53)的患者存在染色体异常（表3)其中数量异常占1L8%(2/17)结构异常占882%(15/17)涉及3种及3种以上的染色体异常的占
T^b3Abnoma丨karyotyPeofyjMMcases
824%(14/17)且多为超二倍体、超三倍体及近四倍体，染色体众数从44条到90条不等。染色体核型异常涉及所有24条染色体，其中涉及1(21扩增、13(4缺失，17P3缺失及14(2易位中至少1种染色体异常的占70.6%(12/17)其中涉及1(1扩增的占1L8%(2/17)涉及13(4缺失的占41.3%(7/17)涉及17P3缺失的占11.8%(2/17)涉及14(2易位的占17.7%(3/17)包括<814)((4(2)在这些患者中涉及2种染色体异常的有2例，1例为1(1扩增伴14(2易位，1例为13(4缺失伴171P3缺失;在所有染色体核型异常的患者中，还发现了一些不常见的结构异常，如t(1116)(U吒3)、（1;2)(巧3(3)叫22)((4?(1)de(5)(P0)i(6)(P0)der(12)((10(10)等;还有一些在急慢性白血病中经常见到的异常，如del(20)((1)、(922)((4(1)等。同时很多病例可见到1条至多条不等的标记染色体（makeralaloan，ema)
FISH检测分析
从53例MM患者中选择2008年门诊及入院患者20例，采用5种探针分别对其进行FIH检测。12例染色体核型正常的患者中有3例FIJH检测阳性，其中1〔21阳性1例，EH阳性1例，还有1例1〔21和RB1均阳性；8例染色体核型异常的患者中有5例FEH检测阳性，其中例19KH阳性，例251C21阳性，例271〔1和均阳性，例28D13S319和巧3均阳性，例29RB1和I§H均阳性(表4)
讨论
多发性骨髓瘤是血液系统恶性疾病中比较难治的一种，由于其临床特征和预后差异大，具有明显的疾病异质性，因此研究工作比较复杂。随着近几年细胞遗传学的不断发展，我们通过对mm进行染色体分析及FSH检测，以研究MM患者的细胞遗传学特点。
通过染色体分析，我们发现有321%的MM患者存在染色体异常，与文献中报道的异常检出率相符1M。除少部分MM患者核型异常为数量异常或简单结构异常外，其余大部分MM患者染色体异常核型均比较复杂，涉及3种及3种以上染色体异常的占824%(14/17)且多为超二倍体、超三倍体及近四倍体染色体众数从44条到90条不等，且异常涉及所有24条染色体，这与文献中所报道的关于MM常规细胞遗传学的特点相一致|5|;每1个MM患者染色体异常核型均不相同，这又符合MM患者具有明显异质性的特点|6]。由于MM患者涉及的到的5种探针对应的染色体异常，包括1扩增、13缺失，13缺失，17p3缺失及14易位。在所有染色体核型异常的MM患者中有7Q6%的患者涉及上述5种异常中的至少1种异常，说明这5种异常在MM患者中比较多见，其中涉及13〔4缺失有7例，涉及14〔32易位有3例，涉及1^1扩增和17^3缺失的各有2例。
缺失是在MM患者中最早发现的染色体异常，有报道称其在MM患者中的检出率占15%-20%,常伴有其他染色体的畸变，是继发浆细胞克隆扩展过程中产生的，也是一个重要且独立的预后不良因素171。14〔32是含编码B细胞免疫球蛋白重链(1H)的基因，有研究显示涉及的易位是MM最常见的异常，也是较为特异的畸变1'以t(1114)(414)(1416)3种类型较为多见，但其作用机制尚不明确。本研究涉及14易位的患者有3例，比文献中报道的检出率低，可能与病例数少及染色体核型过于复杂，标记染色体较多见，无法准确分析有关。本研究发现1例MM患者存在t(14)在MM患者中检出率较低，其涉及的是cmycLmyc编码1种含亮氨酸拉链结构的转录因子，与Rbl酸激酶P107蛋白作用来抑制Rb磷酸化和抑制P107诱导的细胞生长静止。该易位使cmy发生突变而过度表达191。与13〔4缺失及14〔2易位相比较，在MM患者中，1〔1扩增较少见。1〔21扩增主要引起白血病介素6(Interleukin61U)受体的增加，其与1U相结合可刺激浆细胞的分裂和恶性增殖。在本研究中，有2例患者存在1〔21扩增的染色体异常，且其中1例同时伴有14〔32易位。17p3缺失也属于MM不常见的异常，其导致P53基因突变，使其失去调节转录的活性和抑制细胞分离、增殖的能力，最终导致瘤细胞的增殖和分化。本研究中有2例患者存在17p3缺失的染色体异常，其中1例同时伴有13〔4缺失。由于1〔1扩增及17【13缺失的染色体异常病例数较少，其临床意义需进一步扩大实验样本量加以分析。
值得注意的是，我们在分析MM患者染色体异常的过程中发现有部分病例存在不常见的结构异常，如16)(p^巧3)、(1；2)(113〔3)22)(〔4q11)del(5)(q。)(6)(p)der(1；12)(ci0〔10)等，这些异常克隆可能会为我们今后研究MM细胞遗传学提供一些线索和帮助。同时，我们还发现了一些在急慢性白血病中常见的染色体如de(20)(〔11)22)(〔4〔11)，这说明在MM患者中，其临床意义或许与存在于白血病中不一样，还需要通过进一步研究加以分析。在许多MM病例中存在1条至多条标记染色体我们虽然通过染色体分析无法判断其来源，但通过FIH技术或许可以帮助我们进行进一步研究。
采用5种探针对20例MM患者进行FIH检测。我们发现12例染色体核型正常的患者中有3例FEH检测阳性，其中1(21阳性1例，Ig阳性1例，还有1例1(1和RB1均阳性；8例染色体核型异常的患者中有5例FSH检测阳性，其中例19m阳性，例251(1阳性，例271C21和g均阳性，例28D13S319阳性，例29RB1和g均阳性。
通过FIH检测结果我们可以看出，染色体核型正常的患者通过FEH检测仍可见阳性，其阳性率占25%(3/12)染色体核型异常的患者FSH检测阳性率为625%(5/8)例29患者染色体核型未发现涉及14(2的异常，但FEH检测出1H阳性，我们分析可能由于其存在多个标记染色体，涉及到14(2断裂点。上述这些说明FIH技术相对染色体核型分析更能够提高异常的检出率，进一步分析MM复杂的结构异常以及常规显带中来源不明的标记染色体11(0。另有3例患者虽然染色体核型异常，但FISH结果均阴性，我们分析由于其异常染色体均不涉及所检测的5种基因。
总之，FEH技术的应用能够检测出常规显带方法不能发现的异常，提高了MM染色体异常的检出率，扩展了染色体分析的范围，由于其克服了常规细胞遗传学方法的缺陷，促进了MM细胞遗传学的研究。但由于探针的选择不同，我们不能仅通过FIH检测来全面分析MM细胞遗传学的异常，还要通过常规细胞遗传学对MM染色体进行全面分析，2者互相结合，互为补充才能提高染色体异常的识别能力，为进一步认识和掌握MM的细胞遗传学的特点奠定基础，也为临床诊断及治疗MM提供帮助。