DNA纳米结构的生物安全性研究

　　1引言

　　DNA不仅是生命的密码，还可以作为制造纳米级构件和机器的通用元件，基于“自下而上”(bottom-up)的原则可以将DNA分子组装成高度有序可控的DNA纳米结构.自Seeman教授1982年首次制备出DNA纳米结构以来，DNA纳米技术的研究已经取得了突出的进展.目前，各种设计精巧而复杂的DNA纳米结构被应用于分子检测、肿瘤诊断、生物医药、药物输运、生物分子组装、生物传感器、纳米分子机器、靶向治疗等诸多领域.在DNA纳米结构被广泛应用的同时，其安全性包括细胞水平的摄取和毒性，动物水平的吸收、分布、代谢和排泄等也越来越受到研究人员的重视.全面了解DNA纳米结构的安全性，对于优化DNA纳米结构的设计，将其更好地应用于生命科学领域具有重要的意义.

　　本文首先简单介绍了DNA纳米技术的发展以及DNA纳米结构的构建方法和特点，然后分体外细胞和体内动物两个层次，综述了近年来DNA纳米结构的安全性研究进展.最后总结指出，DNA纳米结构的安全性研究工作尚不完善，并展望了在进一步工作中该领域应重点开展的研究方向.

　　2DNA纳米技术简介

　　DNA，即脱氧核糖核苷酸(deoxyribonucleicacid)，作为生命遗传信息的储存物质广泛存在于生物体内.1953年，DNA双螺旋结构的发现极大地促进了现代生命科学的发展.DNA双螺旋结构宽2nm，螺距3.4~3.6nm，每个碱基的长度约0.34nm，这些性质决定了核酸分子在纳米组装时具有尺寸适应性.更重要的是,DNA具有卓越的可编码性，根据碱基配对原则腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)互补配对可以进行精确的设计，从而构造出各种各样的纳米结构[31].1982年,Seeman教授[2]提出，DNA能够通过碱基互补配对原则形成特定的结构，而且单个的结构可以通过粘性末端形成复杂的二维或三维结构，引领了整个DNA纳米技术领域的发展.此后，研究人员以DNA为“建筑材料”，通过“自下而上”的构筑方法，设计合成了各种功能化的DNA以及不同形状的DNA纳米结构，DNA纳米技术也渗入到众多研究领域中.

　　近30年来，DNA纳米技术取得了突飞猛进的发展.DNA纳米技术的最大特点在于可以将DNA序列精确设计和组装成我们想要的结构.当前，构建DNA纳米结构有两种主要的方法：模块结构组装(tile)和DNA折纸术(DNAorigami).模块自组装是层次自组装(hierarchicalassembly),通过将目标结构分解成小的结构单元，利用每个结构单元里核酸链直接的强作用力以及结构单元之间略弱的作用力，形成整个结构.利用该方法可以构造出一维线性排列、二维平面网格、可寻址阵列、纳米纤维、三维多面体乃至三维晶体等多种结构,这种构建方法是DNA折纸术出现之前DNA纳米结构的主要构建方法.2006年，Rothemund发明了DNA折纸术，该技术的出现使得制作复杂DNA纳米结构的能力得到极大提升.DNA折纸术是一种成核自组装(nucleationassembly),整个组装过程围绕若干成核点(或称成核链)一次进行，因此，通过DNA折纸术生成图形的复杂度较模块自组装大大提高.通过DNA折纸技术，研究人员已经构建出了包括笑脸、海豚、中国地图、巨石、螺帽、桥式结构、细颈瓶、立体花瓶、五角星、方形、矩形、三角形、空心盒子、四面体和立方体等各种精巧的纳米图案和纳米结构此外，由DNA模块或是DNA折纸构建的模板中每条钉书链都可以延伸出特定可识别的序列，这使得通过DNA纳米技术构建的模板可以进行进一步的功能化修饰并广泛应用到诸多研究领域中.

　　3DNA纳米结构的安全性研究

　　在纳米领域，每一种新的纳米材料被制备出来并应用到众多研究领域特别是生物医药相关的领域中时，其生物安全性是研究人员首要关心的课题.同样地，DNA纳米结构作为一种新型的纳米材料在被广泛应用的同时，科学家也对其安全性进行了评估，下面将从体外细胞和体内动物两个层次介绍近年来的研究进展.

　　3.1细胞水平

　　细胞是构成生命的基本单位，外界任何有害因子对机体的作用，均可通过细胞形态与功能的改变表现或检测出来.细胞模型具有简单、实验条件的一致性易于控制、实验结果重复性较好等优点.并且，细胞实验所需要的DNA纳米结构的量较少，因此大量工作致力于在细胞水平开展研究.

　　DNA四面体是DNA纳米结构的典型代表，它由4条DNA单链自组装形成，因制备方法简单，产率较高而研究最多.樊春海研究组[43]应用共聚焦显微技术研究了RAW264.7巨噬细胞和荧光标记的DNA四面体的相互作用，孵育2h后，在细胞质中观察到强烈的荧光信号，说明该纳米结构能被细胞大量摄取，而用于合成该四面体的DNA单链和细胞孵育后细胞质中只检测到很微弱的荧光信号，说明四面体结构的形成对于有效的细胞摄取十分重要.流式细胞仪的定量分析结果也显示，与DNA单链相比，形成四面体纳米结构后，细胞的摄取量显著增加.并且，形成DNA四面体结构后能有效抵抗生物介质中核酸酶的降解，在细胞外和未灭活的胎牛血清孵育4h后仍保持完整的四面体结构.与细胞孵育8h后，细胞内分别用Cy3和Cy5标记的四面体两个顶点的荧光仍能很好地重合，充分证明了形成的DNA纳米结构具有良好的稳定性，这也是其能够应用于生物医药领域研究的重要特点之一.进一步地，该研究组使用全内反射显微镜、单粒子示踪等细胞成像技术，实时观察了单个DNA四面体结构穿过细胞膜并在胞内运输的过程(图1),发现DNA四面体结构的细胞摄取是一种能量依赖的过程，在细胞膜上的小窝蛋白介导下产生内吞，该过程可以在1min内完成.随后，DNA四面体结构通过由微管蛋白构成的细胞骨架系统进行运输，并最终到达溶酶体.并且，当DNA四面体结构被连接上信号肽分子后，还可以改变细胞命运.例如，载有核定位序列NLS的DNA四面体结构可以从溶酶体中逃逸出来而进入细胞核内.

　　虽然DNA纳米结构被细胞大量摄取，但是对细胞的生长没有显著影响.例如，Li等_用MTT法检测了DNA四面体纳米结构对RAW264.7巨噬细胞的毒性，发现DNA四面体在浓度为100nmol/L时对细胞存活率没有任何影响.类似地，Charoenphol等和Kim等的工作中分别检测了DNA四面体对宫颈癌细胞HeLa、成纤维细胞NIH3T3和乳腺癌细胞MCF-7等多种细胞存活率的影响，发现即使是使用很高的浓度(250和500nmol/L)也对细胞不显示任何毒性效应.除了四面体结构外，其他形状的DNA纳米结构也具有良好的生物相容性.Jiang等制备了二维管状和三维三角形形状的DNA折纸纳米结构，细胞核形态分析，碘化丙啶(PI)和细胞存活率分析结果显示，这两种纳米结构对正常和耐药的乳腺癌细胞均不显示毒性.同年，Zhao等也制备了管状的DNA折纸纳米结构用于药物输运系统的研究，同样证明了其对乳腺癌细胞不具有任何毒性效应.在无机纳米材料的安全性评估中，研究人员发现其生物相容性常常与形状以及尺寸大小密切相关.例如，球状的纳米金通常生物相容性较好，而棒状结构的纳米金则具有一定的细胞毒性[48].碳纳米材料中，直径较小的单壁碳纳米管毒性常常大于直径较大的多壁碳纳米管相反地，氧化石墨烯则片层越小生物相容性越好.对于DNA纳米结构，其大小、形状均不会影响其生物相容性，这一特点使得研究人员能够按照需要任意设计结构，大大拓展了其在生命科学领域的应用.

　　3.2动物水平

　　与体外细胞实验相比，动物实验能够检测纳米材料在生物体各个脏器的分布情况，追踪纳米材料在体内的代谢和排泄行为，更进一步反应纳米材料和人类相互作用可能产生的生物学效应，从而为其在生物医学领域的应用提供更多有用的信息.

　　在体内研究中，大部分工作也围绕DNA纳米结构的典型代表DNA四面体展开.2012年，Anderson研究组在该领域作出了先驱性的工作，他们设计制备了20nm的DNA四面体结构作为siRNA输运载体并应用于体内研究.由于叶酸受体在许多癌细胞系中过量表达，他们在该寡核苷酸纳米颗粒(oligonu?cleotidenanoparticles)上引入了叶酸分子作为肿瘤靶向配体.制备好的寡核苷酸纳米颗粒通过尾静脉注射进入到肿瘤小鼠体内，荧光分子断层成像融合X射线断层成像(FMT-CT)技术定量分析了24h内寡核苷酸纳米颗粒的体内分布和代谢行为，结果显示，该寡核苷酸纳米颗粒能在肿瘤部位大量富集，并且肾脏有较多摄取，肝和脾有一定摄取，其他器官如肺和心脏等则摄取很少(图2).由于寡核苷酸纳米颗粒载体的载带，siRNA在小鼠体内的血液循环半衰期延长了4倍(从6min延长至24.2min).此外，Surana等在近期发表的综述文章中特别指出，DNA具有一定的免疫原性，很可能引发生命体系的各种免疫反应，因而DNA纳米结构和免疫系统的相互作用是DNA纳米结构安全性评估的又一重要内容.在上述工作中，研究人员注射该寡核苷酸纳米颗粒6h后，血清中干扰素a(IFN-a)水平和对照组相比没有显著差异.这些结果表明，Anderson研究组构建的DNA纳米载体在体内具有良好的稳定性、很强的肿瘤靶向效应以及很低的免疫原性，因而在体内抗肿瘤研究中具有广阔的应用前景.最近，樊春海研究组[54]也制备了连接有叶酸分子的DNA四面体结构，使用近红外荧光基团和放射性核素同时对该DNA纳米结构进行标记，尾静脉注射，考察其在肿瘤小鼠体内的分布和代谢行为.荧光成像以及单光子发射断层成像融合X射线断层成像(SPECT/CT)结果均显示，该DNA纳米结构能很好地在肿瘤部位富集，同时肝、肾和脾等器官也有一定摄取，最后通过尿液排泄出体外.与DNA双链相比，形成四面体纳米结构后，其在小鼠体内的血液循环半衰期提高了一倍，并且该DNA纳米结构能在高浓度小鼠血清中稳定存在12h.这些结果显示，DNA纳米结构在体内多模态分子影像探针研究领域亦有良好的应用前景.

　　在DNA纳米结构相关的各类生物医学研究中，根据不同的实验目的，常常采用不同的给药方式，这使得DNA纳米结构在体内的分布和代谢行为也有所不同.例如，Kim等制备了荧光标记的DNA四面体结构并应用于肿瘤小鼠体内前哨淋巴结(sentinellymphnodes)的成像研究，DNA纳米结构由前肢足垫(forepawpad)皮下注射进入小鼠体内.注射后2h，荧光成像结果显示，四面体结构主要富集在小鼠腋下的前哨淋巴结区域，肾、肝和脾中有少量分布.可见，根据不同的实验目的采取适当的给药方式，可以大大提高DNA纳米结构在特定组织的富集效率，从而更好地应用于进一步的生物学研究.值得注意的是，不同的给药方式下，DNA纳米结构除了在特定组织富集外，在肝、脾等网状内皮系统均有一定的吸收，但最后都能经肾脏被排泄出体外，这说明DNA纳米结构在体内应用中具有良好的安全性.

　　为了达到更好的体内应用效果，丁宝全研究组考察了不同形状的DNA折纸纳米结构在肿瘤小鼠体内的分布和代谢行为.他们选用M13噬菌体DNA和辅助DNA链通过自组装的方式制备了三角形、四边形和管状3种DNA折纸纳米结构，并在纳米结构上连接量子点(QDs)用于荧光成像.尾静脉注射给药结果显示，在3种DNA折纸形状中，三角形折纸具有最好的肿瘤富集效果，并且在其他脏器的分布很少；正方形和管状DNA折纸除了在肿瘤部位富集外，肝脏和肾脏也有很强的吸收(图3(a,b)).进一步地，他们对三角形DNA折纸的体内生物相容性进行了系统评估.

    注射该三角形DNA折纸6h后，早期免疫原性评估实验结果显示，其与对照组相比没有显著性差异(图3(c)),小鼠血液中白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)和血小板(PLT)水平均在正常参考范围内(图3(d)).此外，该DNA纳米结构对肿瘤细胞生长、凋亡和新陈代谢相关的基因表达没有显著影响.注射该纳米载药体系12d后，肿瘤小鼠体重和对照组相比没有明显变化，组织病理学分析结果显示，该纳米载药体系不会导致肝肾毒性.所有这些结果充分说明，三角形的DNA折纸具有良好的肿瘤被动靶向效应和卓越的生物相容性，非常适合应用于进一步的抗肿瘤研究.值得注意的是，虽然DNA纳米结构的大小、形状通常不会影响其生物相容性，但上述研究结果显示，不同的DNA纳米结构的形状在体内的吸收和分布行为有很大不同.因此,为了达到理想的生物学应用效果，在研究中常常需要制备出多种DNA纳米结构，比较各种DNA纳米结构在体内的分布和代谢行为，从而筛选出最优的纳米结构用于进一步的研究4展望当前，各种设计精巧而复杂的DNA纳米结构在生命科学各个领域被广泛应用.与此同时，研究人员对DNA纳米结构的体内外安全性也进行了评估，初步的结果显示，各种DNA纳米结构几乎没有细胞毒性，在生物体内降解后通过代谢排出体外，不会带来脏器的累积毒性问题，因而可以认为其具有良好的生物安全性.

　　但是目前的研究工作中，细胞水平大都只有存活率的检测结果，动物水平检测了有限的血液学和血清免疫学指标，简单观测了主要脏器的病理学切片，这对于表征一种新型的纳米材料是否适合于生物医学甚至是临床应用是远远不够的.进一步的工作中，建议在细胞水平考察DNA纳米结构是否影响各种亚细胞器的形态和功能，是否影响细胞周期进程和细胞分裂等生命活动，动物水平考察DNA纳米结构对各项血液学、血生化以及免疫学指标的影响.另外需要注意的是，DNA作为生命遗传物质普遍存在于生物体内，因此,DNA纳米结构在生物体内降解后的外源DNA小片段很可能被生物体重新利用.这是否会导致基因突变,进而改变后代的遗传学性状也是进一步工作中需要重点关注的问题.这些系统而完善的安全性研究工作将能大大推进DNA纳米结构在生命科学领域的研究进展.