AGR2、Lgr5在结直肠癌中的表达及其临床价值分析

　近年来我国结直肠癌（colorectal cancer，CRC）发病和死亡呈逐年上升趋势，发病率和死亡率明显高于世界平均水平。目前从分子水平上探索CRC的发生机制、侵袭转移的分子基础已成为CRC研究的热点。人前梯度蛋白AGR2（Anterior Gradient-2，Agr2）作为人类早期阶段前后位分化的相关蛋白，是来源于非洲爪蟾蛋白XAG2的人型同系物。众多研究表明，AGR2与多种肿瘤的生成和转移具有密切关系，关于AGR2对肿瘤的调控作用和机制， 已成为目前肿瘤研究领域的又一重要热点。富含亮氨酸的G蛋白偶联受体（leucine-rich repeat-containing G-protein-coupled receptor 5， Lgr5）作为Wnt通路的目标基因，结合R-脊椎蛋白能够使Wnt/β-catenin信号增强， 从而参与了结肠癌等肿瘤的发生。最近研究还发现，Lgr5+干细胞可能是CRC起始细胞，并与CRC的转移、复发以及患者的预后密切相关。本研究采用免疫组化方法检测AGR2、Lgr5在CRC及癌旁正常组织中的表达情况，旨在探讨AGR2、Lgr5在CRC发生发展过程中的作用，初步评价二者联合检测对CRC临床病理诊断的意义，为CRC的分子诊断和治疗提供理论依据。
　　1资料与方法
　　1.1一般资料
　　收集山西医科大学第一临床医院病理科2010年1月～2011年12月间CRC患者的石蜡标本70例，同时对标本的临床病理参数进行分析，其中男28例， 女42例， 年龄29～82岁，平均年龄63.7岁；病理分型中高分化17例， 中分化38例，低分化15例；浸润未及浆膜29例，浸润至浆膜层和浆膜层外41例；无淋巴结转移者39例， 有淋巴结转移者31例。癌旁组织20例，取自上述CRC标本肿块边缘距肿块5 cm或以上正常结直肠黏膜组织石蜡标本，均经病理证实无癌浸润，其中男8例，女12例，年龄31～59岁，平均年龄45.7岁。所有CRC患者术前3个月均未行化疗或放疗检查，且除外其他消化道疾病和其他器官肿瘤病史。
　　1.2 试剂
　　兔抗人AGR2蛋白多克隆抗体购自美国的Proteintech Group Inc公司，兔抗人Lgr5单克隆抗体为Dako公司产品，SABC免疫组化试剂盒及DAB显色剂均购自武汉博士德生物公司。
　　1.3 方法
　　采用免疫组化SABC法。实验步骤按照试剂盒说明进行，切片常规脱蜡至水，枸橼酸盐高温高压修复抗原，一抗AGR2多克隆兔抗，稀释比例为1∶300，37℃孵育1h；一抗Lgr5单克隆抗体，稀释比例为1∶400，4℃过夜孵育。使用DAB显色，应用苏木精对比染色，最后显微镜下观察染色结果。
　　1.4 结果判定标准
　　AGR2蛋白染色以细胞质出现黄色或棕黄色颗粒为阳性细胞。染色评分标准按照着色强度及着色细胞数综合计算，并参照许良中和杨文涛的方法判定结果。每张切片阳性细胞的染色强度按无色、浅黄色、黄色、棕黄色分别计为0、1、2、3分；阳性细胞数计分：无阳性细胞为0分、1%～10%为1分、11%～50%为2分、51%～80%为3分、≥81%为4分；以上两项的乘积0～3分为阴性，4分及以上均为阳性。（4～5分为轻度阳性，6～9分为中度阳性，10分以上为强阳性）。Lgr5蛋白染色以细胞膜和细胞质呈棕黄色颗粒为阳性。在每张切片中随机选取5个高倍镜视野（×200），其中每视野以200个肿瘤细胞计数，最后以阳性细胞占总细胞数百分数<10%的判为染色阴性。
　　1.5统计学处理
　　所有数据均应用 SPSS 17.0 软件包进行统计学处理。计数资料采用相对数表示，样本率之间比较用χ2 检验或 Fisher’s精确概率法。P﹤0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 AGR2蛋白免疫组化检测结果
　　2.1.1 AGR2蛋白的表达和分布 AGR2染色主要定位于细胞质，呈黄色或棕黄色。AGR2在癌旁正常组织细胞中无表达或弱阳性表达，见封三图1 A；在CRC肿瘤细胞呈阳性（见封三图1B）或强阳性表达（见封三图1 C、D），染色分布呈异质性，表现为片状、灶状或散在分布，肿瘤细胞间质无着色。AGR2在CRC组织的阳性表达率（48/70，68.57%）明显高于在癌旁正常组织的阳性表达率（5/20，25.00%），两者差异有统计学意义（χ2=12.198，P﹤0.01），见表1、封三图2。
　2.1.2 不同临床病理特征的CRC组织中AGR2蛋白表达比较 在CRC组织中，AGR2蛋白的阳性表达与患者的性别、年龄、浸润深度无相关性（P>0.05），与癌组织的分化程度及淋巴结转移相关（P﹤0.05）；AGR2在高分化、中分化和低分化组织中的阳性表达率分别为41.18%（7/17）、73.68%（28/38）和86.67%（13/15），差异有统计学意义（P﹤0.05）；有淋巴结转移（26/31，83.87%）的AGR2蛋白表达率显著高于无淋巴结转移（22/39，56.41%）的组别，且差异有统计学意义（P﹤0.05）。见表2。
　　2.2 Lgr5蛋白免疫组化检测结果
　　2.2.1 Lgr5蛋白的表达和分布 Lgr5染色大多定位于细胞质中，部分可细胞质和细胞膜同时着色，呈棕黄色细颗粒状。Lgr5在癌旁正常组织中无表达或弱表达，见封三图3A，在CRC组织中则呈高表达，见封三图3B，染色分布呈局灶、簇状分布或呈弥漫片状分布。Lgr5在CRC组织的阳性表达率（52/70， 74.29%）明显高于在癌旁正常组织的阳性表达率（8/20，40.00%），两者差异有统计学意义（χ2=8.229，P=0.004），见表3、封三图4。
　　2.2.2 不同临床病理特征的CRC组织中Lgr5蛋白表达的比较 在CRC组织中，Lgr5蛋白的阳性表达与患者的年龄、性别无明显相关（P>0.05），与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移相关（P﹤0.05）；肿瘤低分化（12/15，80.00%）、浸及浆膜及浆膜外（35/41，85.37%）、有淋巴结转移（28/31，90.32%）的Lgr5蛋白表达分别显著高于高分化（8/17，47.06%）、未及浆膜（17/29，58.62%）、无淋巴结转移（24/39，61.54%），且差异均有统计学意义（P﹤0.05）。见表2。
　　2.3 AGR2、Lgr5对CRC诊断的评价
　　见表4、封三图5。①AGR2诊断CRC的曲线下面积（AUC）为0.718（95%CI 0.613～0.808），其灵敏度为68.57%，特异度为75.00%；②Lgr5的AUC为0.671（95%CI 0.564～0.767），灵敏度为74.29%，特异度为60.00%；③联合检测AGR2和Lgr5，AUC为0.811（95%CI 0.714～0.886），灵敏度为77.14%，特异度为95.00%；④使用Medcalc软件进行AUC比较，单独检测与联合检测AGR2、Lgr5，差异均有统计学意义（P均<0.05）；而AGR2、Lgr5的AUC比较，差异无统计学意义（P>0.05）。因此，联合检测组织中AGR2、Lgr5的 阳性率可明显提高CRC诊断的灵敏度及特异度。
　　3 讨论
　　3.1 AGR2与Lgr5概况
　　AGR2源自非洲爪蟾蛋白XAG2（Xenopus anterior gradient 2）人型同系物，与爪蛙外胚层的发育过程及早期阶段前后位的分化有关。AGR2 mRNA在人前列腺、乳腺、结肠及胰腺组织的分泌上皮细胞表达，其蛋白主要定位在分泌上皮细胞的细胞质中，是一种分泌性蛋白。本研究观察到AGR2表达主要位于结直肠组织的腺上皮细胞，以细胞质表达为主，且以腺腔面表达为主，这也证实了AGR2蛋白具有分泌特性。
　　Lgr5是近年来新发现的一种新的7次跨膜G蛋白耦联受体家族成员，含7次a螺旋跨膜区和17个富含亮氨酸重复序列，其中N-和C-末端尾部富含半胱氨酸序列， 可在胃肠道、毛囊等多种组织中表达。最近研究还发现，Lgr5是肠道干细胞的特异性分子标记物，并可在CRC中出现过表达，因此猜测它可能是一种CRC的干细胞标记物。
　　3.2 AGR2蛋白与CRC
　　本研究结果显示，AGR2蛋白在CRC组织的阳性表达率（48/70，68.57%）较癌旁正常组织的阳性表达率（5/20，25.00%）明显增加。通过分析CRC组织中AGR2表达与患者临床病理特征发现，AGR2表达与肿瘤组织的分化程度密切相关，低分化CRC组织AGR2阳性率较高分化CRC显著增高，表明肿瘤分化程度越低，AGR2表达量越高。研究还发现，AGR2表达与CRC淋巴结转移密切相关，AGR2在31例有淋巴结转移中的阳性表达率（83.87%）明显高于无淋巴结转移的阳性表达率（56.41%）。上述结果与Valladares等的研究结果一致，他们发现部分CRC肿瘤组织中AGR2的mRNA水平上调，同时高转移性肿瘤的循环肿瘤细胞中表达明显上调，说明AGR2是一种肿瘤转移诱导蛋白。Kim等也进一步证实，AGR2基因在黏液性CRC中cDNA含量较非黏液性CRC上调3.3倍，AGR2的过表达与患者预后差明显相关。上述结果均提示，AGR2在CRC中高表达，其异常表达可能在CRC的发生发展中发挥了一定作用，可作为一种有潜在价值的肿瘤分子标志物。但这种AGR2蛋白在CRC组织中表达上调的机制有待进一步研究。本研究还发现AGR2蛋白表达与年龄、性别、浸润深度及TNM分期均无显著相关性（均P﹥0.05），与文献报道一致。
　　3.3 Lgr5与CRC
　　目前研究发现，Lgr5的过表达可能参与CRC的发生，但是否参与CRC进展及肿瘤转移尚存争议。Ziskin等曾对891例CRC组织中Lgr5进行检测，结果发现Lgr5的表达与肿瘤的侵袭性及预后无关。而Walker等却提出Lgr5表达下调后，肿瘤细胞增殖、浸润和转移的能力反而增强，所以认为Lgr5表达上调与肿瘤细胞黏附力增强和致瘤性降低有关。本研究采用免疫组化方法对CRC组织和正常组织进行检测，结果发现在CRC组织中Lgr5蛋白的阳性表达率显著高于癌旁正常组织（χ2=8.229，P=0.004），结果还显示，Lgr5蛋白表达与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移有关（均P﹤0.05），而与年龄、性别无明显相关性（均P﹥0.05）。本研究结果与Takahashi及Wu等结果相一致，均提示Lgr5表达上调可能促进了CRC恶性转化、侵袭及转移，对于CRC进展发挥了重要作用，因此Lgr5可作为一个判断CRC患者肿瘤进展的指标，但对于Lgr5参与CRC发展的机制尚不明确，仍有待进一步深入研究。
　3.4 AGR2、Lgr5对CRC诊断的价值
　　上述研究表明，AGR2和Lgr5在CRC的进展中发挥了一定作用，同时我们分析了二者在CRC诊断中的价值。通过AGR2、Lgr5诊断CRC的ROC曲线AUC比较显示，单独检测AGR2、Lgr5以及联合检测两者的ROC曲线AUC分别为0.718、0.671和0.811，联合检测二者的灵敏度、特异度（77.14%、95.00%）明显高于单独检测，这提示联合检测对CRC具有较高的诊断价值。Valladares等研究结果显示，联合检测AGR2、Lgr5的ROC曲线AUC为0.767，敏感性和特异性分别为67.4%、94.7%，较我们的实验结果略低，可能由于抗体的差异或研究对象不同所致。
　　综上所述，AGR2及Lgr5在CRC的发生、发展中发挥了一定的作用，两者的表达可能与肿瘤的浸润、恶性转化及淋巴结转移有重要关联， 均可作为有潜在价值的CRC分子标志物。通过对活检标本进行AGR2和Lgr5联合检测，将有助CRC肿瘤浸润、恶性转化及淋巴结转移风险的早期预测，为CRC患者的分子诊断和治疗提供了理论支持。但两者在CRC发生、发展中的作用机制仍有待进一步的研究。
　　
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