血管紧张素II心肌细胞损伤作用

摘　要：目的 观察血管紧张素II刺激心肌细胞后SOD值及细胞凋亡率、并且探讨其机制。方法 1、取SD乳鼠心肌细胞做原代培养，分为空白对照组、AngII刺激组（分为不同浓度组）；2、空白对照组不加任何刺激物。3、AngII组用浓度分别为40、60、80、100umol/L的AngII刺激乳鼠心肌细胞48小时；4、用化学比色法测定SOD活力，流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果AngII刺激乳鼠心肌细胞48小时后细胞凋亡明显、SOD活性降低，且不同浓度AngII组间差异显著（P<0.05）。结论 血管紧张素II可引起鼠心肌细胞损伤，并随浓度增加而加重。

关键词：超氧化物歧化酶；血管紧张素II；心肌细胞；

        心肌细胞的凋亡和坏死在急慢性心力衰竭过程中起了重要的作用，在心力衰竭情况下RAAS（renin-angiotensin-aldosterone system）系统激活，血管紧张素II(AngII)增加，在心肌肥厚及心力衰竭的发生、发展中起着重要的调控作用。本试验在体外乳鼠心肌细胞的原代培养基础上，通过观察血管紧张素II刺激下心肌细胞SOD活力、细胞凋亡，探讨AngII损伤心肌细胞可能的机制。

一、 材料
 （一）细胞来源：新生SD乳鼠心脏分离心肌细胞做原代培养，SD乳鼠由苏州大学动物房提供。
（二）试剂  DMEM培养基、血管紧张素II、二甲基亚砜、胰蛋白酶、EDTA，SOD检测试剂盒，Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒。
（三）仪器 BB-5060型CO2培养箱、IX70型倒置相差显微镜、SW-CJ-1F型净化工作台、LDZ5-2型高速离心机、ULT1386-V34型-80℃冰箱、MDF-U332型-20℃冰箱、HZ-9211K恒温震荡器、DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱、721分光光度计、XW-80A旋涡混匀器、流式细胞仪（型号：FACSVantageSE）。
 二、方法
　　（一）SD乳鼠心肌细胞的提取、纯化和培养
     采用无菌操作的方法取SD乳鼠心脏，用PBS缓冲液反复清洗，用眼科小剪刀剪成1-2m 大小的块状，加入0．25％的胰蛋白酶Ⅱ消化液中，置37℃培养箱孵化5-10min，将上层液体转至DMEM液管中，1000r/min离心3-5min，去上清，用DMEM培养基重悬细胞，保存于37℃CO2培养箱。将未消化完的心肌组织块再加入消化液，重复上述步骤，直至所有心肌组织消化完毕为止。将所得的心肌细胞转至70ml的细胞培养瓶中，37℃ CO2培养箱培养60～90min，待成纤细胞贴壁后，吸取上层细胞悬液至新的培养瓶中，计数后按5×105个/ml将细胞加至96胞培养板，置5％CO2和95％O2的培养箱37℃培养，同时观察和记录心肌细胞的生长状况。
　　（二）试验分组（96孔板中对照组和AngII组分四个浓度组分别取10孔）
　　1、对照组：仅用加入2％新生小牛血清的DMEM培养基。
　　2、AngII组：DMEM培养基中分别加入浓度为20、60、80、100umol/L的血管紧张素II作用48小时。每种处理10个复孔，置于37℃含5%CO2饱和水汽培养箱中培养。
　　（三）SOD、细胞凋亡率的测定
　　1、标本收集
　　细胞按上述不同刺激培养48小时后，吸取培养液上清，置于-20℃保存待测SOD；吸除培养板中培养基上清，剩余细胞收集后用于细胞凋亡率的测定。
　　2、SOD测定、细胞凋亡率均按照试剂盒说明书步骤进行。
　　三、数据处理：
　　采用SPSS11.0统计软件进行分析，所有数据用均数±标准差表示，组间比较用方差分析，P＜0.05认为差异有统计学意义。
　　四、结果
　　Ang-II 刺激乳鼠心肌细胞48小时后，培养上清液中SOD浓度明显低于空白对照组( P<0.05)，且随AngII浓度加大SOD下降明显，不同浓度组间差异显著( P<0.05)（见表1）。各组细胞凋亡率明显高于空白对照组( P<0.05)，且随AngII浓度加大凋亡率升高明显，不同浓度组间差异显著( P<0.05)（见表2）
　　
    
   
   
 

  
讨论
     慢性心衰过程RAAS系统被激活,致血管紧张素II浓度增加，导致心肌损伤。可表现为细胞通透性增加，心肌酶（如CPKMB,ASTMB CTnI）外漏和心肌细胞凋亡、坏死。本文结果显示加入AngII后心肌细胞活力降低，细胞的凋亡率显著增加，与文献报告一致．Mol Cell Cardiol,2001,33 (5)：995-100 3．
　　. Nucleic Acids Res, 2000,28(24):4987-4997.