宫颈癌组织HPV16 URR及E7基因突变和序列多态性分析

【关键词】 宫颈肿瘤;人乳头瘤病毒16;调控序列,核酸;聚合酶链反应

【摘要】 目的 分析山东省青岛地区妇女宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型(hpv16)上游调控区(urr)和e7开放读码框(ofr)基因突变和基因序列多态性。方法 收集山东省青岛地区妇女宫颈癌标本共111例，提取dna作为模板，应用通用引物和型特异引物经聚合酶链反应(pcr)筛选hpv16阳性标本，pcr结合测序检测hpv16阳性标本urr和e7基因全序列，经dnastar 100软件和在线blast分析其变异情况。结果 宫颈癌组织中hpv和hpv16感染率分别为99.10%(110/111)和73.63%(81/110);核苷酸水平上hpv16 urr形成24种变异模式，同源性在98.02%～99.26%之间，nt7518 g→a和nt7861 a缺失变异率均为100%(26/26)。hpv16 e7形成12种变异模式，同源性在99.23%～100%之间;nt647 a→g突变率58.54%(24/41)，氨基酸由asn→ser(n29s)、nt666 g→a突变率24.39%(10/41)，为同义突变。结论 山东省青岛地区妇女宫颈癌组织中hpv16 urr和e7基因均存在变异;hpv16 urr突变热点为nt7518和nt7861，hpv16 e7突变热点为nt647，且二者尚存在未见报道的变异位点。

【关键词】 宫颈肿瘤;人乳头瘤病毒16;调控序列,核酸;聚合酶链反应

　mutation and polymorphism of hpv16 urr and e7 gene in cervical carcer tissue zhao xuezhen, wang yankui, peng lina, et al (department of obstetrics and gynecology, the affiliate hospital of qingdao university medical college, qingdao 266003, china) ; [abstract] objective to analyze the mutation and polymorphism of hpv16 urr and e7 gene in cervical cancer samples in qingdao of shandong province. methods a total of 111 cancer samples were collected in qingdao. the dna was extracted and used as a template. the detection of hpv and the typing of hpv16 carried out using consensus and typespecific primers. the amplifications of hpv16 urr and e7 gene complete sequences were performed by pcr with the hpv16 positive ones. the variation information was analyzed by dnastar 100 and blast online. results the positive rate of hpv and hpv16 was 99.10% (110/111) and 73.63% (81/110), respectively. hpv16 urr fragments formed 24 patterns at nucleotide level, their homology was 98.02% to 99.26%. nt7518 g→a and nt7861 a absence were 100% (26/26); hpv16 e7 fragments formed 12 patterns mutation at amino acid level, their homology was 99.23% to 100%; hpv16 e7 nt647 a→g was 58.54% (24/41), resulting in amino acid ser substituted for asn. nt666 g→a was 24.39% (10/41), without variation of amino acid. conclusion there are variations in both hpv16 urr and e7 genes at nucleotide level in qingdao. the mutational hot spots of hpv16 urr are nt7518 and nt7861 and hpv16 e7 is nt647, both of them still have mutational spots that have not yet been reported.

　　[key words] uterine cervix neoplasms; human papillomavirus 16; regulatory sequence, nucleic acid; polymerase chain reaction

　　人乳头瘤病毒(hpv)是乳头瘤病毒家族中最具多样性的一组病毒，具有严格的宿主范围和嗜组织特异性，为闭环共价小双链dna病毒，主要感染人皮肤或黏膜上皮组织，引起良、恶性疾病并由此分为高危型和低危型。高危型人乳头瘤病毒持续感染是宫颈癌发病的主要病因，其中以hpv16最为常见。有关hpv16基因组单个基因片段变异研究结果的报道，多集中于e6或e7，而联合检测宫颈癌组织中hpv16上游调控区(urr)和e7的报道相对较少且多为国外的报道。另外，山东地区尚无宫颈癌组织hpv16 urr基因变异的研究报道，而这一地区有关hpv16 e7基因变异的分析也未发现其变异[1]。本文联合检测山东省青岛地区妇女宫颈癌组织中hpv16 urr和e7基因片段变异情况，并分析其基因序列多态性。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 宫颈癌组织标本 手术切除宫颈癌组织标本43例，取自2008年3月—2009年3月我院妇科，取材后立即置-80 ℃冰箱保存;宫颈癌组织石蜡切片标本68例，取自2007年9月—2009年3月莱西市人民医院妇科。病人均未接受过放化疗，年龄26～82岁，平均47.5岁。病理学诊断：鳞癌106例，腺癌4例，腺鳞癌1例。临床病理资料于两院病理科获得。

　　1.1.2 主要试剂 taqdna聚合酶、10×pcr buffer、dntp mixture、6×loading buffer、dna分子标志物dl 2000、dna提取试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 引物的设计、合成 βglobin、hpv l1及hpv16 e6、urr、e7引物序列见文献[23]。各引物序列均由上海生物工程技术服务有限公司合成。

　　1.2.2 组织dna提取、pcr反应体系和条件 新鲜组织用酚氯仿异戊醇法常规提取dna,石蜡切片组织按qiampdna提取试剂盒说明书步骤提取dna作为模板。pcr反应总体积均为25 μl，其中模板dna约50 ng，dntp 200 μmol/l，上、下游引物各为0.5 μmol/l，taqdna聚合酶1 u，mgcl21.5 mmol/l，10×pcr扩增缓冲液2.5 μl，加无酶水至25 μl。

　　1.2.3 琼脂糖凝胶电泳 将pcr产物置于16 g/l琼脂糖凝胶中进行电泳。长度为268、450、140、617和315 bp扩增条带分别为βglobin、hpv l1及hpv16 e6、urr、e7目的基因条带。

　　1.2.4 pcr产物测序及序列分析 将pcr产物送北京华大基因研究中心纯化后进行双向测序，凡发现突变的样品均经pcr重新扩增,并再次测序以排除pcr过程中碱基错配而可能产生的误差。最后，应用dnastar 100软件和在线blast查找hpv16 urr和e7基因片段变异位点并进行序列多态性分析。

　　2 结 果

　　2.1 pcr扩增

　　2.1.1 βglobin扩增结果 所有111例标本均在268 bp处出现目的条带。重复检测结果相同，故上述111份标本均纳入本次实验。

　　2.1.2 hpvl1和hpv16 e6扩增结果 110例pcr产物在450 bp处出现目的条带，hpv总感染率为99.10%(110/111)，81例在140 bp处出现目的条带，hpv16阳性率为73.63%(81/110)。

　　2.1.3 hpv16 urr和e7基因片段的扩增结果81例hpv16阳性标本中分别有51例在617 bp处、70例在315 bp处出现目的条带，hpv16 urr和e7双向测序成功者分别为26例和41例。部分标本hpv16 urr和e7基因pcr扩增产物电泳结果见图1、2。

　　m:dna 分子标志物dl 2000;①～⑨部分 hpv16 urr pcr扩增产物条带;⑩阴性对照。

　　图1 部分标本hpv16 urr基因pcr扩增产物电泳结果

　　m:dna 分子标志物dl 2000;①～⑨部分 hpv16 e7 pcr扩增产物条带;⑩阴性对照。

　　图2 部分标本hpv16 e7基因pcr扩增产物电泳结果

　　2.2 测序比对

　　2.2.1 hpv16 urr变异 本研究26例测序成功的hpv16 urr片段显示多个位点的变异，热点突变为nt7518 g→a 和nt7861 a 缺失，均为100% (26/26);而较高变异情况的位点为nt7727 a→c、nt7494 a 缺失，均为69.23% (18/26);nt7839 g→a、nt7928 c→t及nt7477 a缺失，均为61.53%(16/26)。见表1。

　　2.2.2 hpv16 e7变异 hpv16 e7核苷酸水平上一些位点变异引起三联密码子改变，进而引起氨基酸变化;另一些位点突变虽改变了三联密码子，并未导致氨基酸水平上的变化。见表2。

　　3 讨 论

　　hpv的基因变异、病毒持续和反复感染、病毒dna拷贝数及宿主免疫状态等因素与高危型hpv感染者发展为宫颈癌密切相关，其中hpv病毒持续和反复感染、病毒dna高拷贝数可由hpv的型内变异所引起[4]。研究表明，某些特异的hpv变异株更容易形成持续性感染，2000年villa等[5]表1 hpv16 urr dnastar 100和在线blast分析结果表2 hpv16 e7 dnastar 100和在线blast检测结果(n=41)核苷酸位点碱基突变三联密码子改变氨基酸变化氨基酸变化位点突变率研究发现，hpv16的非欧洲型变异株更容易引起持续性感染(or:4.5,95%ci:1.6～12.4)。

　　urr内顺式作用元件的点突变或缺失突变可以改变urr的调控功能，urr的突变可通过阻遏子结合位点的缺失和(或)激活因子结合能力的增强而增强urr的启动活性。本研究成功测序的26例urr片段中此区间有15个位点共计69个核苷酸的碱基发生替换，27个核苷酸的碱基缺失。已有报道此区间nt7729 a→c突变的urr 转录活性是标准株的2～4倍，本研究中nt7727 a→c即为这种突变情况(参考序列不同);另外，本文结果中存在位于特异蛋白1(sp1)和yy1结合位点的nt7839 g→a突变，该突变可能改变p97启动活性，进而改变早期癌基因e6/e7的转录活性，这一突变在韩国妇女宫颈癌组织中也较普遍。

　　schmidt等[6]研究结果显示，波兰妇女宫颈癌组织中hpv16 urr片段100%发生nt7520 g→a的突变，并认为是宫颈癌病人与无症状带毒者的主要区别，该处突变的毒株显示出更强的侵染活性，突变株的转录活性略高于标准株。本研究结果显示，hpv16 urr序列有24种变异模式，有29个位点共计104个核苷酸的碱基发生了替换，75个核苷酸发生了碱基缺失，测序成功的26例hpv16 urr片段均发生了nt7518 g→a突变，该突变与文献报道的nt7521和nt7520实为同一突变(两者的参考序列不同)[78]，说明该位点突变在亚裔美洲型(aa)及亚洲型(as)中普遍存在。另外，测序成功的26例hpv16 urr片段均发生了nt7861 a缺失变异，这一位点的高突变率及其与hpv16 urr调控功能之间的相关性尚未见报道，这为我们今后的研究内容提供了思路。本文还检测到较高的nt7928 c→t、nt7477和nt7479 a缺失的变异情况以及7499、7872、7465、7523、7917和7478等位点的突变,提示山东省青岛地区妇女宫颈癌组织中hpv16 urr变异具有多样性。

　　世界不同地区妇女的宫颈癌组织都普遍存在hpv16 e7变异株。hpv16 e7基因结构变异导致的蛋白质氨基酸水平上的变异势必在一定程度上影响其功能，不同的变异位点抑或会产生生物学功能不同的e7蛋白。hpv16 e7基因第29位密码子突变导致天门冬酰胺变为丝氨酸(asn→ser n29s)，丝氨酸被磷酸化，蛋白质构象和极性可能发生改变，从而改变结合视网膜母细胞抑制基因产物(prb)的能力，影响hpv的转化作用和免疫原性等生物学特性。在韩国妇女中e7 n29s变异会增强e7的致癌性。本研究亦显示了nt647 a→g这一突变情况，且与中国香港地区和日本报道的突变率相似[9]。

　　此外，本研究测序成功的41例hpv16 e7基因片段中，有2例与标准株序列完全一致，除1例nt835位于e7蛋白羧基端外，其余9种变异均位于氨基端，提示hpv16 e7基因片段内氨基端变异相对频繁;而nt590a缺失尚未见大量报道。

　　综上所述，山东省青岛地区妇女宫颈癌组织中hpv16 urr和e7在核苷酸水平上均存在变异，与国外文献报道一致，二者的热点突变及突变率与国内外报道相似，而与国内相关文献报道的hpv16 e7在山东地区“未发现变异”结论不同[1]。这可能与样本的大小、样本的代表性、病人选择标准、实验设计、检测方法等因素存在差异有关，此外，亦不能除外与这一地区e7基因序列存在多态性有关。该地区hpv16 urr和e7还存在尚未见报道的突变位点，提示这一地区hpv16变异具有多样性;相对于hpv16 e7，urr基因片段变异频繁;hpv16 e7基因片段内，变异相对频繁的位点多位于氨基端。hpv16 urr的突变一方面与病毒的感染和宫颈癌的发生相关，另一方面可增强病毒基因的转录活性，hpv16 e7变异会增强其致癌性，故本研究检测到的各种突变与这一地区宫颈癌发生的相关性已成为我们近一阶段正在研究和深入探讨的课题。

【参考文献】
　[1]许雪梅,司静懿,刘世德,等. 中国山东地区妇女宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16 e6 e7基因的分离、克隆和序列分析[j]. 中国医学科学院学报, 1999,21(3):185191.

　　[2]farhadi m, tahmasebi z, merat s, et al. human papillomavirus in sequamous cell carcinoma of esophagus in a highrisk population[j]. world gastroenterol, 2005,28(8):12001203.

　　[3]史文天,王言奎,袁月秀,等. 化学合成sirna沉默宫颈癌siha细胞e6基因表达的进一步研究[j]. 青岛大学医学院学报, 2008,44(3):198200.

　　[4]mayrand m h, coutlee f. detection of human papillomavirus type 16 dna in consecutive genital samples does not always represent infection as determined by molecular variant analysis[j]. clin microbio, 2000,38(9):33883393.

　　[5]villa l l, sichero l, rahal p, et al. molecular variants of human papillomavirus types 16 and 18 preferentially associated with cervical neoplasia[j]. gen virol, 2000,81(12):29592968.

　　[6]schmidt m, kedzia w, cozdzickajozefiak a. intratype hpv16 sequence variantion within lcr of isolates from asymptomatic carriers and cervical cancers[j]. clin virol, 2001,23(12):6577.

　　[7]kurvinen k, yliskoski s, saarikoski s, et al. variants of the long control region of human papillomavirus type 16[j]. eur cancer, 2000,36(11):14021410.

　　[8]余勐,马正海,王艳萍,等. 新疆维吾尔族妇女宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型上游调控区dna 多态性分析[j]. 中华微生物学和免疫学杂志, 2006,26(11):10001004.

　　[9]paul k s c, ching w l, tak h c, et al. human papillomavirus type 16 intratypic variant infection and risk for cervical neoplasia in southern china[j]. infet dis, 2002,186(5):696700.