脂质体流感疫苗制备及体液免疫应答

【摘要】 目的：制备脂质体流感疫苗并对其体液免疫效果和保护效率进行研究。方法：采用薄膜法与冷冻干燥法相结合的方法制得多层脂质体；用制得的脂质体流感疫苗和普通疫苗分别免疫小鼠，用血凝抑制实验（hi）和酶联免疫吸附试验（elisa）对免后2～13周的小鼠血清的抗体水平进行检测，hi检测其特异性抗体，elisa检测igg抗体水平并对小鼠的保护效率进行检测。结果：实验中，脂质体流感疫苗在2 μg/mouse组和4 μg/mouse两个剂量组中，不同免疫时间内其hi值可分别较非脂质体疫苗组高出2～3和4倍，产生抗体的水平经elisa实验得出较非脂质体疫苗组高出1倍左右，故可激发更高的体液免疫；保护效力为4/6。结论：脂质体流感疫苗能够刺激机体产生更高的体液免疫和更高的保护效力。

【关键词】 流感疫苗 脂质体 体液免疫 血凝抑制试验

　　study on preparation of liposomeencapsulated influenza split vaccine and its humoral responses in mice

　　hao shumei, wang yajun①, qi fengchun②, li hongguang.

　　college of life science, changchun university of science and technology, changchun 130022, china;①college of life science, jilin university, changchun 130021, china;②changchun institute of biological products, changchun 130062, china
　　［abstract］ objective:to produce liposomeencapsulated influenza split vaccine and study its humoral response and protective immunity in s:prepared multilaminar liposome vaccine by film evaporaqtion combined with lyophilization; immunized balb/c mice with the obtained liposomeencapsulated influenza split vaccine and the routine influenza split vaccine, serum antibodies were assayed on weeks 213 by the haemagglutinationinhibition(hi) test and elisa, the hi test for the special antiha antigen and the elisa test for the igg. protective immunity against intranasal virus challenge was determined at 12 weeks posts:the liposomeencapsulated influenza split vaccine elicited a higher titer of hi and igg than the nonliposomal vaccine, at interval times, the hi titer of liposomeencapsulated influenza split vaccine could reach 23 times and 4 times more than the nonliposomal vaccine in 2 μg/mouse group and 4 μg/mouse group, and its antigen level examined by elisa was 1 time higher than the nonliposomal vaccine. of the 6 immunized mice, 4 were protected from the challenge with influenza sion:compared with routine influenza split vaccine, the liposomalencapsulated influenza split vaccine induces higher humoral immunity and shows good protection.

　　［key words］ influenza vaccine；liposome；humoral immunization；hi test

　　目前对流感的防治最为有效的一种手段是接种流感疫苗，疫苗的各种佐剂（包括人工合成佐剂和天然佐剂）以及高效载药系统（包括脂质体、微囊等）的研究和使用使疫苗的效果得到很大提高［14］。使用佐剂疫苗可在减少抗原使用量的情况下保持较高免疫效果。脂质体为一种新兴的药物剂型，其在作为药物或疫苗的佐剂或载体方面的效果越来越受到广大医药工作者的关注。本试验的研究目的在于设计一种脂质体包裹的流感疫苗，以达到如下的几点要求：①制备方法简单，使用安全；②能够给机体更有效的保护；③用更少的剂量即能达到免疫效果。本研究表明，脂质体流感疫苗可激发机体产生更强的体液免疫和保护效率。

　　1 材料与方法

　　1.1 流感病毒和抗原 a/california/7/2004(h3n2)毒株及抗原由长春生物制品研究所疫苗六室提供。

　　1.2 实验动物 6周龄洁净级雌性balb/c小鼠，体重18～20 g，由长春生物制品研究所动物室提供。

　　1.3 主要仪器 zetasizer3000hs激光衍射粒度分析仪（英国马尔文公司）；epics xl流式细胞仪（coulter，美国）。

　　1.4 脂质体流感疫苗的制备 采用薄膜法与冷冻干燥法相结合的方法制得多层脂质体，步骤如下：氢化大豆卵磷脂（pc）（德固赛公司，德国）和胆固醇（sigma，美）混合溶于氯仿，40℃真空旋转蒸发，成膜［5］。加水，剧烈震荡，水浴超声约1小时致淡云雾状，按比例与流感裂解疫苗混合，冻干。

　　1.5 脂质体流感疫苗的性质研究

　　1.5.1 脂质体的形态学观察 分别用高倍显微镜（100×物镜）及电镜对制得的脂质体进行形态学观察。

　　1.5.2 脂质体的粒径分析 室温下用zetasizer 3000hs激光衍射粒度分析仪对制得的脂质体粒径进行分析，测定其粒径分布和平均粒径。

　　1.5.3 脂质体包封率的测定 采用lowry法，测定上清中的蛋白质含量。

　　1.6 脂质体流感疫苗的体液免疫效果评价

　　1.6.1 balb/c小鼠的免疫 小鼠分为5组，每组5只，用2 μg抗原/只和4 μg抗原/只的剂量分别对其进行免疫，设脂质体流感疫苗组，流感抗原组并设对照组。

　　1.6.2 体液免疫检测 分别对免疫后不同阶段（免后2～13周）采集的血清进行检测，用hi（heamagglutinationinhibition）方法检测特异性抗体（抗血凝素抗体），用间接elisa方法检测血清中igg抗体水平［6，7］。

　　1.7 脂质体流感疫苗的保护效果评价［8］ 由于流感病毒感染几乎不会造成动物个体的死亡，其疫苗的保护效率只能通过疫苗对感染小鼠的肺部的保护率来体现。用0.02 ml流感病毒鸡胚尿囊液（10-8.0 eid50）对免后12周的小鼠进行鼻腔攻击。6天后，处死小鼠，无菌取肺，观察其病灶的多少，没有肺部病灶的小鼠认为受到保护，用mdck细胞检测小鼠肺部的流感病毒滴度（肺部病毒滴度定义为能够引起cpe的肺内容物的最大稀释倍数）。

　　2 结果

　　2.1 脂质体流感疫苗的性质

　　2.1.1 形态观察 为了验证制得的脂质体的基本形态和其直径的大致范围，由高倍显微镜及透射电镜观察可见，该方法制备的脂质体呈圆形或椭圆形，粒径分布较均匀，直径大约在微米级，证明了制得的脂质体的完整性，其粒径符合粒径测定要求，见图1和图2。

　　2.1.2 粒径测定结果 为了更精确的测得脂质体粒径，室温下用zetasizer 3000hs激光衍射粒度分析仪对制得的脂质体的粒径进行分析，测定其粒径分布和平均粒径。可见80%以上的脂质体粒径在3.86～35.35 μm之间，这个粒径范围表明了制得的脂质体可大大增强其结合抗原的抗原性，见图3。

　　图1 脂质体流感疫苗的电镜照片（略）

　　fig.1 the electron micrographs of influenza split virus liposome

　　图2 脂质体流感疫苗的100×显微镜照片（略）

　　fig.2 the 100× micrograph of influenza split virus liposome

　　图3 用malvern zetasizer 3000hs激光粒度分析仪粒径测定结果（略）

　　fig.3 the diameter distribution of liposomes determined by malvern zetasizer 3000hs

　　note:the average vesicle size distribution was determined by numberbased.

　　2.1.3 包封率测定 为了测定脂质体对流感抗原的包封率，采用lowry法分别测定脂质体悬液的总蛋白量为155.75 μg及其除去脂质体后上清液中蛋白量为13.35 μg，按公式计算得脂质体包封率为91.1%，表明了制得的脂质体对流感疫苗具有较高的包封效率。

　　2.2 脂质体流感疫苗的免疫效果

　　表1 免后2～13周的小鼠hi结果（略）

　　tab.1 the hi titer of 213 weeks after immunization

　　表2 免后2～13周小鼠elisa结果（略）

　　tab.2 the elisa titer of 213 weeks after immunization

　　表3 脂质体流感疫苗对免后12周小鼠的保护效力

　　tab.3 protection against a/california/7/2004(h3n2) virus infection in preimmunized balb/c mice

　　2.2.1 hi测定特异性抗体结果 为了检测脂质体流感疫苗的特异性免疫效果，采用hi测定免后一段时间的小鼠血清，对实验结果应用spss 11.5软件进行统计分析：nonliposomal、liposomal和对照组两两相比，组间有显著性差异（p<0.01）。2 μg/mouse组和4 μg/mouse两个剂量组对比可以得出，4 μg/mouse组的脂质体疫苗组的hi指数提高的更多，为非脂质体疫苗组的4倍左右，可见高剂量组免疫效果优于低剂量组。随着免疫时间的延长，hi指数逐渐升高，在4～6周达到峰值，两个剂量组都显示非脂质体疫苗组hi值升高缓慢，峰值较低。而脂质体疫苗组hi值迅速升高，峰值较高，见表1，该结果证明了脂质体流感疫苗可产生较同等剂量的非脂质体疫苗高得多的特异性抗体。

　　2.2.2 elisa测定igg结果 为了进一步检测脂质体流感疫苗刺激小鼠机体产生igg抗体水平，采用elisa法对免后一定时间的小鼠血清进行测定。该elisa试验所测的样品均为10倍稀释后的血清样品。测定的结果应用spss 11.5软件统计分析：nonliposomal、liposomal和对照组两两相比，组间有显著性差异（p<0.01）。2 μg/mouse组和4 μg/mouse两个剂量组对比可以得出，4 μg/mouse组的脂质体疫苗组的igg水平提高的更多，为非脂质体疫苗组的2倍左右，可见高剂量组免疫效果优于低剂量组。随着免疫时间的延长，igg水平逐渐升高，在4～6周达到峰值，两个剂量组都显示，非脂质体疫苗组igg水平升高缓慢，峰值较低。而脂质体疫苗组igg值迅速升高，峰值较高。试验结果证明，脂质体流感疫苗组可刺激机体产生较非脂质体流感疫苗为高的igg抗体，见表2。

　　2.3 保护性试验 为了获得脂质体流感疫苗对机体抵抗流感病毒更直接和可信的数据，进行了保护性试验，结果显示，脂质体流感疫苗组保护率最高，肺内容物流感病毒滴度最低。表明了脂质体流感疫苗对机体的保护效果要高于非脂质体流感疫苗，见表3。

　　3 讨论

　　机体对外界细菌和病毒的抵抗主要存在两个免疫途径：一是体液免疫，二为细胞免疫。

　　体液免疫主要是由b细胞介导的，免疫后导致机体合成抗ha、na等主要糖蛋白的抗体，血清抗体主要为3种免疫球蛋白：igg、igm和iga，与其他病毒感染一样，最初应答为igm，然后才是限制病毒再感染的iga和igg。体液免疫应答最终效应是将侵入机体的非己细胞或分子加以清除，即排异效应。但抗体本身只具有识别作用，并不具有杀伤或排异作用，因此体液免疫的最终效应必须借助机体的其它免疫细胞或分子的协同作用才能达到排异的效果。主要有：①抗体分子的中和作用；②抗体分子的调理作用；③补体介导的细胞溶解作用；④抗体依赖细胞介导的细胞毒作用。

　　本试验采用脂质体做佐剂包封流感疫苗，通过血凝抑制实验（hi）和酶联免疫吸附试验（elisa）对免后几周的小鼠血清的抗体水平进行检测，hi检测其特异性抗体，elisa检测总抗体水平。在免后12周用活毒a3（h3n2 eid50=10-8.0）对小鼠进行攻击，1周后检测小鼠肺部病变，测得疫苗对小鼠机体的保护效率。hi及elisa实验表明，脂质体流感疫苗较单纯抗原具有明显的优势，相同剂量下，脂质体流感疫苗可激发更多的抗体；免疫后小鼠血清中的抗体高峰期持续时间较长。疫苗的保护效率无佐剂疫苗为2/6，相应脂质体流感疫苗为4/6。实验过程中，我们认为有几个值得注意的方面：

　　 ①注射途径的问题：注射途径一般有肌肉注射、腹腔注射、皮内注射、皮下注射和静脉注射。我们分别采用以上途径对小鼠进行免疫，4周后采血测其hi，从而得出在本实验条件下各注射途径产生的免疫效果由强到弱依次为：静脉＞腹腔＞肌肉＞皮下＞皮内。鉴于静脉注射难度较大，故我们采用了免疫效果较强的腹腔免疫途径。

　　 ②脂质体粒径大小的问题：脂质体粒径对脂质体疫苗的免疫效果影响很大，理论上说，粒径越大免疫效果越强，故作为佐剂一般制备mlv型脂质体。但粒径过大给后段的除菌造成很大的困难。故脂质体粒径适中是脂质体制备过程中的一个难题。我们发现，脂质水化过程中的超声时间是影响脂质体粒径大小的一个主要因素：超声时间越长粒径越小。超声时间分别控制在0.5、1.0和1.5小时的粒径测定结果分别为22.85、15.51和12.25 μm。另外，我们发现，采用我们现在使用的卵磷脂膜材，超声时间达到一定程度以后脂质体的粒径很难再减小。笔者认为，这可能和用来做脂质体膜材的卵磷脂的质量有关系，采用纯度较高、组成较单一、分子量差别较小的卵磷脂作膜材或可得到更小粒径的脂质体。

【参考文献】
　　1 hughs h p a, babiuk l a. the adjuvant potential of cytokines ［j］. biotechnol ther, 1992;10:101117.

　　2 zanvit p, havlickova m, tancer j et al. immune response after adjuvant mucosal immunization of mice with inactivated influenza virus ［j］. immunology letters,2005;97:251259.

　　3 alving c r. liposomes as adjuvants for vaccine ［m］. in: levine m m, woodrow g c, kaper j b, edt. new generation vaccines, 2nd ed. new york: marcel dekker, 1997:207213.

　　4 hideki asanuma, katsuiku hirokawa, masanori uchiyama et al. immune responses and protection in different strains of aged mice immunized intranasally with an adjuvantcombined influenza vaccine ［j］. vaccine,2001;19:39813989.

　　5 张灵芝.脂质体制备及其在生物医学中的应用 ［m］.北京：北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社,1998:2832.

　　6 wang d q, christopher m e, nagata l p et al. intranasal immunization with liposomeencapsulated plamid dna encoding influenza virus hemagglutinin elicits mucosal, cellular and humoral immune responses ［j］.j clinical virology, 2004;31:s99s106.

　　7 babai i, samira s, barenholz y et al. a novel influenza subunit vaccine composed of lipsosomeencapsulated haemagglutinin/neuraminidase and il2 or gmcsf.i. vaccine characterization and efficacy studies in mice ［j］. vaccine, 1999;17:12231238.

　　8 ai ninomiya, kazumasa ogasawara,kiichi kajino et al. intranasal administration of a peptide vaccine encapsulated in liposome together with an anticd40 antibody induces protective immunity against influenza a virus in mice ［j］. vaccine, 2002;20:31233129.