《现代生物科技专题》中克隆技术的研究

　　克隆(英语：Clone)，在广义上是指利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因组后代的过程。在生物学上，是指选择性地复制出一段DNA序列(分子克隆)、细胞(细胞克隆)或个体(个体克隆)。

　　一、分子水平的克隆—PCR技术

　　该科技技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。

　　PCR由三个基本反应步骤：①模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链 DNA解旋，使之成为单链，以便它与引物结合;②模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板 DNA单链的互补序列配对结合;③引物的适温延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

　　二、细胞水平的克隆—动物细胞培养技术

　　动物细胞培养是用酶解法将组织碎块分离成单个细胞，用培养液制成细胞悬浮液，在体外适宜条件下使细胞生长繁殖，并保留一定的结构和功能特性。

　　(一)细胞培养所需的条件

　　1.培养液

　　现多用合成培养液。合成培养液有多种，不同培养液适用于不同细胞。可根据培养细胞的特殊要求进行添加：抗生素、有机补充物(如丙酮酸钠，谷胺酰氨等)、促细胞分裂因子(生长因子类的FGF等)、贴壁和铺展因子(如胶原蛋白，纤粘蛋白等)。

　　2.血清

　　在细胞培养液中必须添加一定量的血清方能获得成功。血清中除了含有细胞生长的部分氨基酸外，还有促进细胞生长和贴壁的成分。不同动物血清的作用差别很大，即使同一种动物的不同个体间的差异也很显著。不同种细胞要求血清量也不同，大部分细胞生长液中加入10%血清已可满足细胞生长要求。目前国内外正在研制无血清培养液，以避免血清中某些物质对细胞生长和病毒复制的影响。

　　细胞生长的PH为6.6-7.8，但最适PH 7.0-7.4。培养液中的缓冲体系主要是碳酸氢盐、磷酸氢盐和血清。

　　4.温度

　　细胞培养的最适宜温度应与细胞来源的动物体温一致。

　　此外，成功的细胞培养还需要严格的无菌操作及洁净的培养器皿。

　　(二)细胞生长的三个阶段

　　1.潜伏期

　　细胞从接种到贴壁生长繁殖的一段时间。

　　2.指数生长期

　　指数生长期是细胞活力最好的时期，在接种细胞数量适宜情况下，指数生长期持续3-5d后，随细胞数量不断增多，生长空间日趋减少，细胞相互接触汇合成片，呈现接触抑制。而恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区分正常与癌细胞标志之一。

　　3.停滞期

　　即细胞数量达到饱和密度后，细胞与营养液的交换面积减少，代谢产物积累，PH下降细胞停止增殖，进入停滞期。

　　(三)动物细胞的培养

　　1.原代细胞(primary cell)

　　动物组

　　织经胰蛋白酶等消化、分散、获得单个细胞，在培养皿中大多数组织均可制备原代细胞，但生长的快慢及难易程度不一。原代细胞一般对病毒较易感染，尤其是来源于胚胎或幼畜组织的细胞。

　　2.二倍体细胞株(diploid cell strain)

　　将长成的原代细胞消化分散成单个细胞，继续培养传代，其细胞染色体数与原代细胞一样，仍为二倍体。此种细胞数量可扩大，对病毒的易感性则基本无变化。

　　3.传代细胞系(establishell cell line)

　　与上述两类细胞不同，这类细胞在传代过程中染色体发生异常变异，在体外可无限制分裂。

　　三、个体水平的克隆—动物细胞核移植技术

　　所谓细胞核移植技术，就是将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中，使后者不经过精子穿透等有性过程即可被激活、分裂并发育成新个体，使得核供体的基因得到完全复制。

　　(一)供体核的获得

　　供体核可以是早期胚胎细胞、胚胎干细胞和体细胞。早期都采用合子核到64细胞期的胚胎细胞核质体分裂球作供体细胞核，80年代开始，随着胚胎干细胞(embryo stem cells，ES)的建立和对其研究的深入，人们对胚胎干细胞在核移植方面的应用前景寄予厚望，但ES建系太困难，仅在小鼠上获得成功。1997年 Dolly羊的出现，开始了体细胞的核移植，并发展很快。

　　(二)受体细胞去核

　　作为细胞核移植的受体细胞主要有三类：去核的卵母细胞、受精卵和2-细胞胚胎，其中卵母细胞应用最为广泛。研究证明，体外成熟培养的卵母细胞核移植成功率不如体内成熟的卵母细胞，其原因可能是卵母细胞在体外成熟过程中，需要合成一些蛋白质来完成第一次减数分裂，其活动有可能受到抑制。

　　(三)核卵重组

　　在显微操作仪操纵下，用一直径接近卵裂球大的移植针吸取一枚分离出的完整卵裂球，注入去核的受体卵母细胞的间隙中，根据移入的部位不同，可分为带下移植和细胞质内注射。在移植针移开后，对移植卵裂球上方的透明带施加压力使卵裂球与卵母细胞接触。

　　(四)细胞融合与激活

　　由于卵细胞去核过程中破坏了卵膜和一部分细胞质，若直接移植，成功率很低，故需对重组胚融合，其采用的方法有仙台病毒法、物理或化学方法(如电融合法、钙离子载体、乙醇、蛋白质酶合成抑制剂等)激活受体细胞，使其完成细胞分裂和发育过程，电融合法更常用。

　　(五)重构胚培养与移植

　　重构胚需一定时间的培养，方可移植到受体，家兔和猪重构胚在体外培养24h以内，就可通过非手术移植，而羊和牛重构胚所需培养时间较长，一般发育到囊胚或桑椹胚时移植。

　　作者：陈燕 来源：学校教育研究 2016年5期