光学检测论文

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　　高分辨率光学显微术在生命科学中的应用

　　【摘要】 提高光学显微镜分辨率的研究主要集中在两个方面进行，一是利用经典方法提高各种条件下的空间分辨率，如用于厚样品研究的SPIM技术，用于快速测量的SHG技术以及用于活细胞研究的MPM技术等。二是将最新的非线性技术与高数值孔径测量技术（如STED和SSIM技术）相结合。生物科学研究离不开超高分辨率显微术的技术支撑，人们迫切需要更新显微术来适应时代发展的要求。近年来研究表明，光学显微镜的分辨率已经成功突破200nm横向分辨率和400nm轴向分辨率的衍射极限。高分辨率乃至超高分辨率光学显微术的发展不仅在于技术本身的进步，而且它将会极大促进生物样品的研究，为亚细胞级和分子水平的研究提供新的手段。

　　【关键词】 光学显微镜；高分辨率；非线性技术；纳米水平

　　在生物学发展的历程中显微镜技术的作用至关重要，尤其是早期显微术领域的某些重要发现，直接促成了细胞生物学及其相关学科的突破性发展。对固定样品和活体样品的生物结构和过程的观察，使得光学显微镜成为绝大多数生命科学研究的必备仪器。随着生命科学的研究由整个物种发展到分子水平，显微镜的空间分辨率及鉴别精微细节的能力已经成为一个非常关键的技术问题。光学显微镜的发展史就是人类不断挑战分辨率极限的历史。在400～760nm的可见光范围内，显微镜的分辨极限大约是光波的半个波长，约为200nm，而最新取得的研究成果所能达到的极限值为20～30nm。本文主要从高分辨率三维显微术和高分辨率表面显微术两个方面，综述高分辨率光学显微镜的各种技术原理以及近年来在突破光的衍射极限方面所取得的研究进展。

　　1 传统光学显微镜的分辨率

　　光学显微镜图像的大小主要取决于光线的波长和显微镜物镜的有限尺寸。类似点源的物体在像空间的亮度分布称为光学系统的点扩散函数(point spread function, PSF)。因为光学系统的特点和发射光的性质决定了光学显微镜不是真正意义上的线性移不变系统，所以PSF通常在垂直于光轴的x-y平面上呈径向对称分布，但沿z光轴方向具有明显的扩展。由Rayleigh判据可知，两点间能够分辨的最小间距大约等于PSF的宽度。

　　根据Rayleigh判据，传统光学显微镜的分辨率极限由以下公式表示[1]：

　　横向分辨率(x-y平面)：dx，y=■

　　轴向分辨率(沿z光轴)：dz=■

　　可见，光学显微镜分辨率的提高受到光波波长λ和显微镜的数值孔径N.A等因素的制约；PSF越窄，光学成像系统的分辨率就越高。为提高分辨率，可通过以下两个途径：（1）选择更短的波长；（2）为提高数值孔径, 用折射率很高的材料。

　　Rayleigh判据是建立在传播波的假设上的，若能够探测非辐射场，就有可能突破Rayleigh判据关于衍射壁垒的限制。

　　2 高分辨率三维显微术

　　在提高光学显微镜分辨率的研究中，显微镜物镜的像差和色差校正具有非常重要的意义。从一般的透镜组合方式到利用光阑限制非近轴光线，从稳定消色差到复消色差再到超消色差，都明显提高了光学显微镜的成像质量。最近Kam等[2]和Booth等[3]应用自适应光学原理，在显微镜像差校正方面进行了相关研究。自适应光学系统由波前传感器、可变形透镜、计算机、控制硬件和特定的软件组成，用于连续测量显微镜系统的像差并进行自动校正。 一般可将现有的高分辨率三维显微术分为3类：共聚焦与去卷积显微术、干涉成像显微术和非线性显微术。

　　2.1 共聚焦显微术与去卷积显微术 解决厚的生物样品显微成像较为成熟的方法是使用共聚焦显微术(confocal microscopy) [4]和三维去卷积显微术(three-dimensional deconvolution microscopy, 3-DDM) [5]，它们都能在无需制备样品物理切片的前提下，仅利用光学切片就获得样品的三维荧光显微图像。

　　共聚焦显微术的主要特点是，通过应用探测针孔去除非共焦平面荧光目标产生的荧光来改善图像反差。共聚焦显微镜的PSF与常规显微镜的PSF呈平方关系，分辨率的改善约为■倍。为获得满意的图像，三维共聚焦技术常需使用高强度的激发光，从而导致染料漂白，对活生物样品产生光毒性。加之结构复杂、价格昂贵，从而使应用在一定程度上受到了限制。

　　3-DDM采用软件方式处理整个光学切片序列，与共聚焦显微镜相比，该技术采用低强度激发光，减少了光漂白和光毒性，适合对活生物样品进行较长时间的研究。利用科学级冷却型CCD传感器同时探测焦平面与邻近离焦平面的光子，具有宽的动态范围和较长的可曝光时间，提高了光学效率和图像信噪比。3-DDM拓展了传统宽场荧光显微镜的应用领域受到生命科学领域的广泛关注[6]。

　　2.2 选择性平面照明显微术 针对较大的活生物样品对光的吸收和散射特性，Huisken[7]等开发了选择性平面照明显微术(selective plane illumination microscopy，SPIM)。与通常需要将样品切割并固定在载玻片上的方式不同，SPIM能在一种近似自然的状态下观察2～3mm的较大活生物样品。SPIM通过柱面透镜和薄型光学窗口形成超薄层光，移动样品获得超薄层照明下切片图像，还可通过可旋转载物台对样品以不同的观察角度扫描成像，从而实现高质量的三维图像重建。因为使用超薄层光，SPIM降低了光线对活生物样品造成的损伤，使完整的样品可继续存活生长，这是目前其他光学显微术无法实现的。SPIM技术的出现为观察较大活样品的瞬间生物现象提供了合适的显微工具，对于发育生物学研究和观察细胞的三维结构具有特别意义。

　　2.3 结构照明技术和干涉成像 当荧光显微镜以高数值孔径的物镜对较厚生物样品成像时，采用光学切片是一种获得高分辨3D数据的理想方法，包括共聚焦显微镜、3D去卷积显微镜和Nipkow 盘显微镜等。1997年由Neil等报道的基于结构照明的显微术，是一种利用常规荧光显微镜实现光学切片的新技术，并可获得与共聚焦显微镜一样的轴向分辨率。干涉成像技术在光学显微镜方面的应用1993年最早由Lanni等提出，随着I5M、HELM和4Pi显微镜技术的应用得到了进一步发展。与常规荧光显微镜所观察的荧光相比，干涉成像技术所记录的发射荧光携带了更高分辨率的信息。（1）结构照明技术：结合了特殊设计的硬件系统与软件系统，硬件包括内含栅格结构的滑板及其控制器，软件实现对硬件系统的控制和图像计算。为产生光学切片，利用CCD采集根据栅格线的不同位置所对应的原始投影图像，通过软件计算，获得不含非在焦平面杂散荧光的清晰图像，同时图像的反差和锐利度得到了明显改善。利用结构照明的光学切片技术，解决了2D和3D荧光成像中获得光学切片的非在焦平面杂散荧光的干扰、费时的重建以及长时间的计算等问题。结构照明技术的光学切片厚度可达0.01nm，轴向分辨率较常规荧光显微镜提高2倍，3D成像速度较共聚焦显微镜提高3倍。（2）4Pi 显微镜：基于干涉原理的4Pi显微镜是共聚焦/双光子显微镜技术的扩展。4Pi显微镜在标本的前、后方各设置1个具有公共焦点的物镜，通过3种方式获得高分辨率的成像：①样品由两个波前产生的干涉光照明；②探测器探测2个发射波前产生的干涉光；③照明和探测波前均为干涉光。4Pi显微镜利用激光作为共聚焦模式中的照明光源，可以给出小于100nm的空间横向分辨率，轴向分辨率比共聚焦荧光显微镜技术提高4~7倍。利用4Pi显微镜技术，能够实现活细胞的超高分辨率成像。Egner等[8，9]利用多束平行光束和1个双光子装置，观测活细胞体内的线粒体和高尔基体等细胞器的精微细节。Carl[10]首次应用4Pi显微镜对哺乳动物HEK293细胞的细胞膜上Kir2.1离子通道类别进行了测量。研究表明，4Pi显微镜可用于对细胞膜结构纳米级分辨率的形态学研究。（3）成像干涉显微镜(image interference microscopy, I2M)：使用2个高数值孔径的物镜以及光束分离器，收集相同焦平面上的荧光图像，并使它们在CCD平面上产生干涉。1996年Gustaffson等用这样的双物镜从两个侧面用非相干光源（如汞灯）照明样品，发明了I3M显微镜技术(incoherent, interference, illumination microscopy, I3M），并将它与I2M联合构成了I5M显微镜技术。测量过程中，通过逐层扫描共聚焦平面的样品获得一系列图像，再对数据适当去卷积，即可得到高分辨率的三维信息。I5M的分辨范围在100nm内。

　　2.4 非线性高分辨率显微术 非线性现象可用于检测极少量的荧光甚至是无标记物的样品。虽有的技术还处在物理实验室阶段，但与现有的三维显微镜技术融合具有极大的发展空间。（1）多光子激发显微术：(multiphoton excitation microscope，MPEM)是一种结合了共聚焦显微镜与多光子激发荧光技术的显微术，不但能够产生样品的高分辨率三维图像，而且基本解决了光漂白和光毒性问题。在多光子激发过程中，吸收几率是非线性的[11]。荧光由同时吸收的两个甚至3个光子产生，荧光强度与激发光强度的平方成比例。对于聚焦光束产生的对角锥形激光分布，只有在标本的中心多光子激发才能进行，具有固有的三维成像能力。通过吸收有害的短波激发能量，明显地降低对周围细胞和组织的损害，这一特点使得MPEM成为厚生物样品成像的有力手段。MPEM轴向分辨率高于共聚焦显微镜和3D去卷积荧光显微镜。（2）受激发射损耗显微术：Westphal[12]最近实现了Hell等在1994年前提出的受激发射损耗(stimulated emission depletion, STED）成像的有关概念。STED成像利用了荧光饱和与激发态荧光受激损耗的非线性关系。STED技术通过2个脉冲激光以确保样品中发射荧光的体积非常小。第1个激光作为激发光激发荧光分子；第2个激光照明样品，其波长可使发光物质的分子被激发后立即返回到基态，焦点光斑上那些受STED光损耗的荧光分子失去发射荧光光子的能力，而剩下的可发射荧光区被限制在小于衍射极限区域内，于是获得了一个小于衍射极限的光点。Hell等已获得了28nm的横向分辨率和33nm的轴向分辨率[12,13]，且完全分开相距62nm的2个同类的分子。近来将STED和4Pi显微镜互补性地结合，已获得最低为28nm的轴向分辨率,还首次证明了免疫荧光蛋白图像的轴向分辨率可以达到50nm[14]。（3）饱和结构照明显微术：Heintzmann等[15]提出了与STED概念相反的饱和结构照明显微镜的理论设想，最近由Gustafsson等[16]成功地进行了测试。当光强度增加时，这些体积会变得非常小，小于任何PSF的宽度。使用该技术，已经达到小于50nm的分辨率。（4）二次谐波 (second harmonic generation, SHG)成像利用超快激光脉冲与介质相互作用产生的倍频相干辐射作为图像信号来源。SHG一般为非共振过程，光子在生物样品中只发生非线性散射不被吸收，故不会产生伴随的光化学过程，可减小对生物样品的损伤。SHG成像不需要进行染色,可避免使用染料带来的光毒性。因其对活生物样品无损测量或长时间动态观察显示出独特的应用价值，越来越受到生命科学研究领域的重视[17]。

　　3 表面高分辨率显微术

　　表面高分辨率显微术是指一些不能用于三维测量只适用于表面二维高分辨率测量的显微技术。主要包括近场扫描光学显微术、全内反射荧光显微术、表面等离子共振显微术等。

　　3.1 近场扫描光学显微术 近场扫描学光显微术(near-field scanning optical microscope, NSOM)是一种具有亚波长分辨率的光学显微镜。由于光源与样品的间距接近到纳米水平，因此分辨率由光探针口径和探针与样品之间的间距决定，而与光源的波长无关。NSOM的横向分辨率小于100nm，Lewis[18]则通过控制在一定针尖振动频率上采样，获得了小于10nm的分辨率。NSOM具有非常高的图像信噪比，能够进行每秒100帧图像的快速测量[19]，NSOM已经在细胞膜上单个荧光团成像和波谱分析中获得应用。

　　3.2 全内反射荧光显微术 绿色荧光蛋白及其衍生物被发现后，全内反射荧光(total internal reflection fluorescence，TIRF)技术获得了更多的重视和应用。TIRF采用特有的样品光学照明装置可提供高轴向分辨率。当样品附着在离棱镜很近的盖玻片上，伴随着全内反射现象的出现，避免了光对生物样品的直接照明。但因为波动效应，有小部分的能量仍然会穿过玻片与液体介质的界面而照明样品，这些光线的亮度足以在近玻片约100nm的薄层形成1个光的隐失区，并且激发这一浅层内的荧光分子[20]。激发的荧光由物镜获取从而得到接近100nm的高轴向分辨率。TIRF近来与干涉照明技术结合应用在分子马达步态的动力学研究领域, 分辨率达到8nm，时间分辨率达到100μs[21]。

　　3.3 表面等离子共振 表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR) [22]是一种物理光学现象。当入射角以临界角入射到两种不同透明介质的界面时将发生全反射，且反射光强度在各个角度上都应相同，但若在介质表面镀上一层金属薄膜后，由于入射光被耦合入表面等离子体内可引起电子发生共振，从而导致反射光在一定角度内大大减弱，其中使反射光完全消失的角度称为共振角。共振角会随金属薄膜表面流过的液相的折射率而改变，折射率的改变又与结合在金属表面的生物分子质量成正比。表面折射率的细微变化可以通过测量涂层表面折射光线强度的改变而获得。

　　1992年Fagerstan等用于生物特异相互作用分析以来，SPR技术在DNA-DNA生物特异相互作用分析检测、微生物细胞的监测、蛋白质折叠机制的研究，以及细菌毒素对糖脂受体亲和力和特异性的定量分析等方面已获得应用[23]。当SPR信息通过纳米级孔道[24]传递而提供一种卓越的光学性能时，将SPR技术与纳米结构设备相结合，该技术的深入研究将有可能发展出一种全新的成像原理显微镜。

　　【参考文献】
　　[1] 汤乐民,丁 斐.生物科学图像处理与分析[M].北京:科学出版社,2005：205.

　　[2] Kam Z, Hanser B, Gustafsson MGL, et ational adaptive optics for live three-dimensional biological imaging[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2001,98:3790-3795.

　　[3] Booth MJ, Neil MAA, Juskaitis R, et al. Adaptive aberration correction in a confocal microscope[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2002, 99:5788-5792.

　　[4] Goldman RD,Spector cell imaging a laboratory manual[J].Gold Spring Harbor Laboratory Press,2005.

　　[5] Monvel JB,Scarfone E,Calvez SL,et -adaptive deconvolution for three-dimensional deep biological imaging[J].Biophys,2003,85:3991-4001.

　　[6] 李栋栋,郭学彬,瞿安连.以三维荧光反卷

章云的主要论文

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求论文！题目：提高数控车床工作实效得用途径

　　提高数控车床工作实效得用途径

　　摘 要 随着经济的发展，科学技术日新月异，机械制造业面临着更高更新的要求：最大程度地和计算机技术、信息技术相结合以实现智能化、自动化、高产、高效、低能耗、无污染的目标，本文从几个方面介绍先进制造技术，指明机械制造业的发展方向。 关键字 先进制造技术 机械制造业作为一个传统的领域已经发展了很多年，积累了不少理论和实践经验，但随着社会的发展，人们的生活水平日益提高，各个方面的个性化需求越加强烈。作为已经深入到各行各业并已成为基础工业的机械制造业面临着严峻的挑战。 先进制造技术这个概念的提出为机械制造业的发展指明了方向。虽然这个名词没有确定的定义，但目前公认的认识是：先进制造技术是传统制造技术不断吸收机械、电子、信息、材料、能源和现代管理等方面的成果，并将其综合应用于产品设计、制造、检测、管理、销售、使用、服务的制造全过程，以实现优质、高效、低耗、清洁、灵活的生产，并取得理想技术经济效果的制造技术的总称。它具有如下一些特点： 1． 从以技术为中心向以人为中心转变，使技术的发展更加符合人类社会的需要。 2． 从强调专业化分工向模糊分工、一专多能转变，使劳动者的聪明才智能够得到充分发挥。 3． 从金字塔的多层管理结构向扁平的网络化结构转变，减少层次和中间环节。 4． 从传统的顺序工作方式向并行工作方式转变，缩短工作周期，提高工作质量。 5． 从按照功能划分部门的固定组织形式向动态的自主管理的小组工作方式转变。 6． 机械制造技术的发展趋势可以概括为：（1）机械制造自动化。（2）精密工程。（3）传统加工方法的改进与非传统加工方法的发展。 下面对自动化技术给予论述和展望。 机械制造自动化技术始终是机械制造中最活跃的一个研究领域。也是制造企业提高生产率和赢得市场竞争的主要手段。机械制造自动化技术自本世纪20年代出现以来，经历了三个阶段，即刚性自动化、柔性自动化和综合自动化。综合自动化常常与计算机辅助制造、计算集成制造等概念相联系，它是制造技术、控制技术、现代管理技术和信息技术的综合，旨在全面提高制造企业的劳动生产率和对市场的响应速度。 一、集成化 计算机集成制造（CIMS）被认为是21世纪制造企业的主要生产方式。CIMS作为一个由若干个相互联系的部分（分系统）组成，通常可划分为5部分： 1． 工程技术信息分系统 包括计算机辅助设计（CAD），计算机辅助工程分析（CAE），计算机辅助工艺过程设计（CAPP），计算机辅助工装设计（CATD）数控程序编制（NCP）等。 2． 管理信息分系统（MIS） 包括经营管理（BM），生产管理（PM），物料管理（MM），人事管理（LM），财务管理（FM）等。 3． 制造自动化分系统（MAS） 包括各种自动化设备和系统，如计算机数控（CNC），加工中心（MC），柔性制造单元（FMS），工业机器人（Robot），自动装配（AA）等。 4． 质量信息分系统 包括计算机辅助检测（CAI），计算机辅助测试（CAT），计算机辅助质量控制（CAQC），三坐标测量机（CMM）等。 5． 计算机网络和数据库分系统（Network & DB） 它是一个支持系统，用于将上述几个分系统联系起来，以实现各分系统的集成。 二、智能化 智能制造系统可被理解为由智能机械和人类专家共同组成的人机一体化智能系统，该系统在制造过程中能进行智能活动，如分析、推理、判断、构思、决策等。 在智能系统中，“智能”主要体现在系统具有极好的“软”特性（适应性和友好性）。在设计和制造过程中，采用模块化方法，使之具有较大的柔性；对于人，智能制造强调安全性和友好性；对于环境，要求作到无污染，省能源和资源充分回收；对于社会，提倡合理协作与竞争。 三、敏捷化 敏捷制造是以竞争力和信誉度为基础，选择合作者组成虚拟公司，分工合作，为同一目标共同努力来增强整体竞争能力，对用户需求作出快速反应，以满足用户的需要。为了达到快速应变能力，虚拟企业的建立是关键技术，其核心是虚拟制造技术，即敏捷制造是以虚拟制造技术为基础的。敏捷制造是现代集成制造系统从信息集成发展到企业集成的必由之路，它的发展水平代表了现代集成制造系统的发展水平，是现代集成制造系统的发展方向。 实现敏捷制造的技术基础包括： 1． 大范围的通讯基础结构，要求在全国范围内建立工厂信息网络和准时信息系统（Just-In-Time-Information）。 2． 柔性化、模块化的产品设计方法。 3． 高柔性、模块化、可伸缩的制造系统。 4． 为定单而设计、制造的生产方式。 5． 基于任务的组织与管理。 6． 基于信任的雇佣关系。 四、虚拟化 “虚拟制造”的概念于20世纪90年代初期提出。虚拟制造以系统建模和计算机仿真技术为基础，集现代制造工艺、计算机图形学、信息技术、并行工程、人工智能、多媒体技术等高新技术为一体，是一项由多学科知识形成的综合系统技术。虚拟制造利用信息技术、仿真计算机技术对现实制造活动中的人、物、信息及制造过程进行全面的仿真，以发现制造中可能出现的问题，在产品实际生产前就采取预防的措施，从而达到产品一次性制造成功，来达到降低成本、缩短产品开发周期，增强产品竞争力的目的。 五、清洁化 清洁生产是指：将综合预防的环境战略，持续应用于生产过程和产品中，以便减少对人类和环境的风险。 清洁生产的两个基本目标是资源的综合利用和环境保护。对生产过程而言，清洁生产要求渗透到从原材料投入到产出成品的全过程，包括节约原材料和能源，替代有毒的原材料和短缺资源，二次能源和再生资源的利用，改进工艺及设备，并将一切排放物的数量与毒性削减在离开生产过程之前。对于产品而言，清洁生产覆盖构成产品整个生命周期的各个阶段，即从原材料的提取到产品的最终处理，包括产品的设计、生产、包装、运输、流通、销售及报废等，合理利用资源，并最大限度地减少对人类和环境的不利影响。 综上所述，机械制造业的发展方向是将传统的制造技术与现代信息技术、管理技术、自动化技术、系统工程技术进行有机的结合，通过计算机技术是企业产品在全生命周期中有关的组织、经营、管理和技术有机集成和优化运行，在企业产品全生命周期中实现信息化、智能化、集成优化达到产品上市快、服务好、质量优成本低的目的，进而提高企业的柔性、健壮性和敏捷性，是企业在激烈的市场竞争中立于不败之地。 参考文献 [1] 机械制造技术基础，张世昌著，天津大学出版社 [2] 计算机辅助设计与制造，李佳著，天津大学出版社 [3] CIMS论坛网页