cancers杂志

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探索肿瘤微环境(TME)有助于了解潜在的肿瘤-免疫相互作用。如何在有限样本上实现高通量、高精度多组学分析已成为未来肿瘤微环境研究的重要方向，而多重免疫组化（mIHC）技术与分子条形码技术的结合将会更好地帮助科研者对TME进行深入研究。

为了深入研究肿瘤微环境对对非小细胞肺癌(NSCLC)的影响，James Monkman等科学家团队利用DSP技术，通过对NSCLC及配对正常组织中的特定空间区域进行高维度蛋白组学定量分析，描绘了NSCLC中由癌旁到基质微环境到癌组织中的蛋白表达谱变化，并在《Cancers》杂志上（IF=6.639）发表题为“High-Plex and High-Throughput Digital Spatial Profiling of Non-Small-Cell Lung Cancer（NSCLC）”的文章（图1）。 该 研究证明了DSP在数据产出、可靠性和研究实效性上的强大优势，并可作为唯一的技术策略实现大规模临床组织样本的深度微环境解析 。

研究亮点

研究团队使用DSP技术，仅用一张TMA组织芯片，从空间层面将非小细胞肺癌（NSCLC）患者的肿瘤、TME和正常相邻组织划分出来，并从免疫细胞分型、免疫激活、药物靶点和肿瘤多个模块进行多重蛋白靶点（Table 1）比较分析，得到富含空间信息、高维度的蛋白表达图谱。研究团队绘制了活检样本中的肿瘤标志物和分子表型，并展示了DSP技术对新一代病理学研究的强大优势。

研究背景

肺癌被称为头号癌症杀手，非小细胞肺癌占肺癌总数的85%。肺癌常在晚期被确诊，导致其预后很差，五年生存率低于20%。随着新兴疗法免疫检查点阻断疗法的成功应用，15-40%的患者生存期延长，因此需要更为准确的预前分子标志物来指导患者分层治疗。免疫环境（细胞类型、密度和位置以及表型和免疫细胞功能）已被用于更深入地了解肿瘤-免疫细胞相互作用，可以为免疫检查点疗法的突破提供全新的治疗线索。

传统的免疫组织化学（IHC）技术及从组织块获取基因组信息的技术无法同时满足空间信息及多重靶标的需求，并且缺乏细胞占比、异质性和深层次的空间信息，而这些对识别TME是非常重要的，同时珍贵样本，如穿刺样本的限制导致无法在有限样本上获得更多有价值的信息。

研究思路及方法

研究者以92个非小细胞肺癌样本为研究对象制成TMA芯片，运用了DSP技术，在PanCK、CD3、CD45的荧光形态学指导下，将组织划分成为肿瘤、基质TME和相邻正常组织（NAT）三个区域，共96个感兴趣区域（ROI）。该技术通过DNA探针编码偶联的抗体（包含免疫细胞分析、IO药物靶标、免疫激活状态、免疫细胞分型中的主要靶点，具体靶标见Table 1）对同一切片进行孵育，基于可视化形态学染色生成肿瘤（Pan ck+）和TME（CD45+/Pan ck-）区域。DSP通过紫外照射将特定区域的DNA编码分解下来，杂交并用nCounter系统进行计数。

ROI与病人相关信息见Table 2。研究者将用R中“ggplot2”输出和绘制原始数据，并将靶标表达值与阴性内参IgG进行比较来评估表达量，并使用“ggpubr”评估标准化校正参数之间的皮尔逊相关系数，选择了相对表达稳定的Histone H3和S6进行标准化。配对组差异表达用配对t检验和benjamini-hochberg FDR修正进行评估，未配对组差异表达用mann-whitney检验和Benjamini-Hochberg FDR矫正进行评估。同时进行非监督聚类分析，用“Survival Analysis”进行单变量Cox比例风险回归。

研究结果

一、ROI选择策略

作者共设定了96个ROI，其中45个肿瘤区域、32个TME和19个形态正常的邻近组织（具体信息见Table 2）。病理学专家根据H&E标出肿瘤区域（示例图2A,2C），与PanCK（绿色）、CD45（黄色）、CD3（绿色）和核染（蓝色）的形态学标记（示例图2B,2D）一起使用来选择肿瘤（CK+）或TME（CK-/CD3+）的感兴趣区域。其中图2B/2D左下ROI为肿瘤，右上圈选为TME，图3展示了具有代表性的成对肿瘤和免疫ROI，ROI 71、69、74和63代表肿瘤区域，而图上其余ROI分别代表配对患者的免疫区域。

二、数据质控

数据质控采用DSP自带分析系统进行。探针计数值根据各ROI内阴性对照兔（Rb）IgG和小鼠（Ms）IgG计数几何平均进行质控（图4A）。作者发现靶标数值因各自的组织类型而不同，例如正常组织ROI原始计数似乎低于其他组织，而肿瘤ROI在最低丰度的探针产生更高的计数（图4B）。在所有ROI内与IgG的均值信号比值均小于1（粉色区域）的靶标，在后续研究谨慎处理，在CD25靶标以上的55个探针中有31个被认为是可信的，可进一步分析（图4A）。

三、数据归一化策略

通过Histone H3、S6、GAPDH和IgG阴性对照探针各校正因子之间的相关性来评估ROI的数据标准化方法。研究者对管家蛋白GAPDH、Histone H3、S6和Ms/Rb IgG的平均值（图5）进行两两比较，并进行线性回归分析，管家蛋白在ROI中彼此高度相关（图5A-C），Ms和Rb IgG在ROI中彼此高度相关（R=0.92）（图5D），并且这些IgG计数的平均值与Histone H3和S6平均值显示出很强的相关性（R=0.91），表明IgG阴性对照、Histone H3和S6与基础生物学信息无关，可作为校正因子进行数据标准化（图5E)。另外，研究团队还分析了ROI面积和细胞核计数，以确定它们对DSP数据进行归一化的效用。ROI面积与其他校正因子的相关性较差（图6A-C），因此不适用于此次试验的数据归一化处理，同样可见核计数（6E，D）。最终研究者选择Histone H3/S6均值用于数据标准化以及探针量化比较。

四、数据分析

研究者先使用Ward D2层次聚类法进行聚类，发现不同组织类型内蛋白靶标似乎没有显著差异，NAT、肿瘤和TME之间的区别并不明显（图7）。使用K-means聚类进一步将ROI分组，大多数NAT分在一组（图7左），其特征是除Pan CK、EpCAM和Ki-67之外，大多数基因高表达。另一类包括TME和肿瘤（图7中），大多数蛋白质表达较低，一些ROI内Ki-67和EpCAM高表达，而第三类所有蛋白质表达相对差异较大（图7右）。

接下来研究者评估了配对和未配对患者的差异蛋白表达（图8）。有趣的是，配对的TME和NAT组（n=8）无显著差异（图8A)，配对的TME-肿瘤组(n=18)，TME区域CD27、CD3、CD4、CD44、CD45、CD45RO、CD68、CD163和VISTA高表达（同预期），而肿瘤区域Ki-67、EpCAM和cytokeratin富集（图8B)。

研究者将所有样本合并，发现无论是否配对，TME中CD34、fibronectin、IDO1、LAG3、ARG1和PTEN似乎相对于NAT下调（图8C）。而TME组与肿瘤组的比较与配对数据相似，CD3、CD45RO、VISTA和CD163在TME中表达比肿瘤高（图8D)。通过未调整的单变量Cox比例风险回归对蛋白表达和OS关联进行评估。研究人员发现，ROI（免疫TME内）的EpCAM和cytokeratin表达与更好的OS相关，而肿瘤ROI区域中CD34、CD3和ICOS的存在与更好的OS相关。

当置于多变量模型中，调整年龄、AJCC和TNM肿瘤分期变量时，在单变量模型中显著表达的蛋白表现为不显著，并且由于样本数量不足不能进行更深层次的数据分析。

文章总结

研究团队使用DSP技术，运用TMA策略，绘制了NSCLC微环境图谱，发现了一些新的分子表型，这些有可能预测患者对新疗法的反应，进而预测患者的预后情况。作者认为多重免疫组化结合高通量靶标检测的技术，与TMA联合应用，正在开创一个新的生物标记物发现领域，将会给临床病理学带来很大的改变。

今又生的有效作用

对参加今又生Ⅰ期临床试验的12例喉癌患者4～6年的随访表明，截至2005年11月，11/12例病人存活，平均生存时间5.9年，无病生存者9/12例；5年生存率91.7%。根据美国癌症联合委员会（AJCC）2002年的最新统计数据，喉鳞状细胞癌5年生存率：Ⅰ期68.6-71.1%，Ⅱ期55.5-59.9%，Ⅲ期46.4-50.1%。中国国内文献报导各类各期喉癌的5年生存率：69.96%。Ⅰ期临床试验随访结果表明，今又生可预防肿瘤（喉癌）复发并明显延长患者生存期。今又生与放疗、化疗、手术及热疗等联合使用具有显著的协同效果，可将疗效提高3倍以上。在今又生治疗头颈部鳞癌多中心、随机对照临床试验中，入组患者77%为Ⅲ-Ⅳ期（中晚期）；多数患者已接受过放疗或化疗治疗但已复发（治疗失败），或不能耐受化疗或放疗以及无法手术的病人。结果显示：今又生联合放疗组的肿瘤完全消退率（CR）达64%，肿瘤部分消退率（PR）29%，有效率（CR+PR）93%；单纯放疗组CR率为19%，PR率为60%，有效率为79%；两组间CR、PR率有显著差异（p<0.01）。基因治疗联合放疗将单纯放疗的肿瘤完全消退率（CR率）提高约3.4倍，p<0.01。截至目前，今又生已治疗数千名国内外癌症患者（包括欧美白种人）。治疗鼻咽癌、头颈部鳞癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌等40余种实体瘤。给药途径包括局部（瘤内注射、支气管滴注、胸/腹腔灌注、动脉灌注）及全身（静脉内）给药。剂量为1～4×1012VP/次/周。用药患者中，多数为晚期甚至终末期、常规治疗方法（手术、放疗及化疗等）失败的恶性肿瘤。临床应用结果显示今又生疗效肯定，使用安全。部分临床研究结果已发表在国际著名杂志《人类基因治疗》上[Peng Z. Current status of gendicine in China: recombinant human Ad-p53 agent for treatment of cancers. Hum Gene Ther. 2005, 16(9): 1016-27]。