生物论文有关病毒

生物论文有关病毒

关于生物的议论文：

微生物是包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物、显微藻类等在内的一大类生物群体，它个体微小，却与人类生活关系密切。涵盖了有益有害的众多种类，广泛涉及健康、食品、医药、工农业、环保等诸多领域。

微生物对人类最重要的影响之一是导致传染病的流行。在人类疾病中有50%是由病毒引起。微生物导致人类疾病的历史，也就是人类与之不断斗争的历史。在疾病的预防和治疗方面，人类取得了长足的进展，但是新现和再现的微生物感染还是不断发生，像大量的病毒性疾病一直缺乏有效的治疗药物。

微生物千姿百态，有些是腐败性的，即引起食品气味和组织结构发生不良变化。当然有些微生物是有益的，它们可用来生产如奶酪，面包，泡菜，啤酒和葡萄酒。

微生物非常小，必须通过显微镜放大约1000倍才能看到。比如中等大小的细菌，1000个叠加在一起只有句号那么大。想象一下一滴牛奶，每毫升腐败的牛奶中约有5千万个细菌，或者讲每夸脱牛奶中细菌总数约为50亿。也就是一滴牛奶中可能含有50亿个细菌。

微生物能够致病，能够造成食品、布匹、皮革等发霉腐烂，但微生物也有有益的一面。最早是弗莱明从青霉菌抑制其它细菌的生长中发现了青霉素，这对医药界来讲是一个划时代的发现。后来大量的抗生素从放线菌等的代谢产物中筛选出来。抗生素的使用在第二次世界大战中挽救了无数人的生命。

一些微生物被广泛应用于工业发酵，生产乙醇、食品及各种酶制剂等；一部分微生物能够降解塑料、处理废水废气等等，并且可再生资源的潜力极大，称为环保微生物；还有一些能在极端环境中生存的微生物，例如：高温、低温、高盐、高碱以及高辐射等普通生命体不能生存的环境，依然存在着一部分微生物等等。

看上去，我们发现的微生物已经很多，但实际上由于培养方式等技术手段的限制，人类现今发现的微生物还只占自然界中存在的微生物的很少一部分。

求论文：病毒中核算在分子生物学中的应用

【综述】
几种用于发现未知病毒核酸序列的技术及其应用
翁康生
病毒是引发人类传染性疾病的主要病原体之一, 它们极
大地威胁着人类健康。目前还存在人类尚未认知或新出现的
病毒, 随时可能严重危害人类健康安全〔1 - 3〕。及早地发现,
鉴别未知的或新出现的病毒, 是有效的预防和控制的先决条
件之一。因此, 建立、储备、改良、发展、乃至创新应用于
发现、鉴别未知或新出现病毒的技术方法是十分必要的。
近20 多年来, 常采用传统的微生物学技术方法和现代分
子生物学技术方法相结合的途径, 发现和鉴别未知病毒。通
过细胞培养的方法分离病毒、电镜观察、用已知病毒的抗血
清建立的免疫学方法作排他性检测、用已知病毒核酸序列建
立的PCR、杂交等方法, 作特异核酸序列的检测、用分子生物
学技术获得未知病毒核酸序列, 查询基因数据库, 检出并确
定未知病毒基因组序列, 最终发现鉴别出未知病毒。
对于无法用细胞分离培养的未知病毒, 有的采用免疫学
与分子生物学技术相结合, 筛选获取病毒特异抗原编码基因
的克隆, 进而发现鉴别出该病毒。更多的则是采用相应的分
子生物学技术, 从被检样品中发现获取未知病毒的核酸序列,
进而发现鉴别未知病毒。无论未知病毒是否可以用细胞培养
分离, 最终对其基因组序列的测定分析, 是鉴别和判断的决
定性依据之一, 而获取未知病毒的核酸序列是前提条件。
从少量样品中, 从高度复杂的宿主细胞核酸物质中, 分
离、扩增、获取足够量的无基因序列资料的未知病毒的核酸
片段, 供进一步克隆、测序、生物信息学分析, 是用分子生
物学技术发现、鉴别未知和新出现病毒的关键之一〔4〕, 也是
最终测定分析, 拼接出未知和新出现病毒基因组序列的瓶颈
步骤。病毒所携核酸物质有DNA 和RNA 之分, 可采用的技术
方法也有所不同, 现将有关技术与其应用作一简介, 以供
参考。
1 代表性差异分析法
代表性差异分析法是为寻找分析两个生物样品复杂的基
因组间有何差异而发展建立起来的分子生物学技术方法, 并
不断得到演化, 发展和应用。病毒感染宿主细胞后, 与未感
染的同类细胞相比, 二者核酸物质间的差异主要在于是否存
在病毒核酸。消减去二者核酸间相同序列的背景部分, 扩增、
比较、选取余下可能存在差异的部分, 进一步分析以发现未
知病毒的核酸序列。病毒的核酸结构各有不同, 可选用相应
的代表性差异分析法, 见表1 。
111 DNA 代表性差异分析法(DNA Representation difference
analysis , DNA RDA)
此方法是Lisitsyn 等〔5〕利用核酸消减杂交技术〔6〕、PCR 方法
和双链DNA 热变性后互补链退火复性的二级动力学原理〔7 - 8〕
作者单位:上海市疾病预防控制中心 200336
表1 病毒核酸类型与各代表性差异分析法的选用
病毒核
酸类型
DNA RDA c DNA RDA
非rRNA 序列
6 核苷酸引导
c DNA RDA
ds DNA 线状√
ds DNA 环状√
ss RNA polyA( + ) √
ss RNA polyA( - ) 3 √
ds RNA polyA( - ) √
3 负链ss RNA polyA( - ) 视病毒在宿主细胞的转录机制而定。
而建立的。方法中将需分析的样品DNA(Test DNA ,T- DNA) 和
对照DNA(Driver DNA ,D - DNA) 设为二组,分别用同一种限制
性内切酶酶切处理,并接上5′端去磷酸化的人工接头,补齐接
头后,加入与接头序列互补的引物作PCR 扩增。切除扩增产物
上的人工接头后,切出的T - DNA 连上第二种人工接头,变性
后与过量的变性D - DNA 杂交。通过杂交,消减去T- DNA 中
与D - DNA 中同源的核酸序列,而只存在于T - DNA 中的靶序
列DNA(Target DNA) 则自我退火复性,其两端连有第二种人工
接头。加入与第二种接头互补的引物作PCR ,只有靶序列DNA
呈指数扩增,因而得到进一步富集。进过如此重复的几个轮回
后,以电泳检测比较T- DNA 和D - DNA ,将T- DNA 中呈现的
差异部分作分离,克隆,序列分析。
Lisitsyn 等以10μg 人淋巴细胞基因组DNA 作为D - DNA ,
在相同的人DNA 中加入相当于单拷贝量的120 pg 腺病毒DNA
作T- DNA。以此作为实验模型,用DNA 代表性差异分析法成
功的寻找、鉴定出外加入的腺病毒DNA 序列。应用此技术,
Chang 等〔9〕在艾滋病相关的卡波西肉瘤(Kaposis Sarcoma) 中发现
一段类似人类疱疹病毒的基因, 并由此发现一种新的病毒
HPV8。以后人们又以此技术发现鉴定了HPV6、TTV 病毒、黄热
病毒样基因组、MDV 等〔10 - 13〕DNA 病毒。
112 cDNA 代表性差异分析法(cDNA Representation difference
analysis , cDNA RDA)
Hubank 等〔14〕针对mRNA 所含序列相对简单的特点,提出
了cDNA 代表性差异分析法。它的基本原理与DNA RDA 相同,
主要不同在于,采用识别4 核苷酸序列的限制性内切酶,它的
识别位点在mRNA 反转录成的cDNA 中出现的频率更高,平均
酶切片段长度约256 bp ,保证了cDNA 序列群中绝大多数序列,
至少被切出一个片段可扩增,供差异分析,分离鉴定。
cDNA RDA 技术相对经济,可高效灵敏地用于非常少的起
始材料而获得结果〔15〕。具有polyA( + ) - RNA 病毒,其核酸可
类似于mRNA 分离纯化,因此可应用此技术。利用cDNA RDA
技术,发现鉴定了TiV、MenV ,等〔16 ,17〕RNA 病毒。
113 非rRNA 序列6 聚核苷酸引导反转录的cDNA RDA
中国预防医学杂志2007 年6 月第8 卷第3 期 Chin Prev Med , June 2007 , Vol18 No13 ·317 ·
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polyA( - ) - RNA 病毒,其核酸物质不似于mRNA ,需和宿
主细胞总RNA 同时分离,并用随机引物作反转录。因为宿主细
胞总RNA 中rRNA 约占80 % ,由于竞争反应、靶序列信号被湮
灭等原因,从这样的总RNA 抽提物中,用随机6 聚核苷酸引物
引导反转录的cDNA RDA 技术,发现鉴别polyA( - ) - RNA 病
毒核酸序列是困难的。Endoh 等〔18〕罗列了6 聚核苷酸所有可
能的排列组合,共计4 096 个序列模式,以大鼠18S、518S、28S 等
rRNA、微卫星重复序列、SARS - CoV、BI - 3 病毒等的序列数据
为模型,筛选出在rRNA 序列中出现频率极低或不出现的6 聚
核苷酸序列模式共96 种。将这些序列分别合成并混合后,称
之为非rRNA 序列6 聚核苷酸引物。生物信息学分析96 种序
列模式在哺乳动物病毒科具代表性的1 791 个病毒基因组序列
中出现的频率,数据表明,非rRNA 序列6 核苷酸引物可引导绝
大多数病毒的cDNA 合成。分别用非rRNA 序列6 聚核苷酸引
物和随机6 核苷酸引物作cDNA 反转录效率、cDNA RDA 试验,
结果表明,二类引物对人工合成的RNA (二类引物在其序列中
出现的频率相似) 反转录效率几乎相等,而前者对细胞总RNA
反转录效率远低于随机引物。用二类引物作cDNA RDA ,检测
人工合成的RNA ,前者灵敏度是用随机引物的30 倍。在模拟
实验中用非rRNA 序列6 聚核苷酸引物引导反转录,串联cDNA
RDA 技术,检测鉴别出感染细胞的BI - 3 和SRAS - Cov 核酸序
列片段。
此方法能从1μg 总RNA 中检测出3 ng 的外来RNA ,其检
测灵敏度不及普通的PCR 检测方法,但对于检测鉴别在宿主细
胞中复制,但不知其基因序列的poly A( - ) - RNA 病毒而言,也
是一个可选择的方法。
114 抑制消减杂交
cDNA RDA 技术结合消减杂交和PCR 抑制作用〔19〕的技术
原理,Diatchenks 等〔20〕等发展出了抑制消减杂交技术( suppression
subtractive hybridization ,SSH) 。与前两种RDA 技术不同点在于,
SSH 技术将内切酶酶切处理的T - cDNA 分为两份,分别接上
不同序列的去磷酸化的接头1 和2 ,分别于过量的D - cDNA
作第一轮杂交。杂交过程中两组中的单链T - cDNA 浓度趋
同,T- cDNA 中的非靶序列单链cDNA 与D - cDNA 中相应序列
形成杂交双链而被消减, T - cDNA 中差异表达的单链cDNA
被显著富集。合并一轮杂交物,加入过量变性D - cDNA ,作第
二轮杂交。合并的二组份一轮杂交物中剩下的趋同化、经消减
杂交后的单链T - cDNA 能互补杂交, 可以形成: 原组内
T- cDNA 单链间的杂交、T - cDNA 与D - cDNA 单链间的杂
交、二组间T- cDNA 单链间的杂交。补齐杂交反应后双链cD2
NA 末端,用分别与接头1 和2 的外侧部分序列互补的寡核苷
酸为引物,作PCR 扩增。二组份间T- cDNA 互补单链杂交物,
因两端分别具有接头1 和2 ,可被指数扩增;T - cDNA 与D -
cDNA 杂交物和剩余单链T- cDNA ,因一端具接头序列,被线性
扩增;而同组间T- cDNA 杂交物两端具反转重复长序列,因抑
制性PCR 效应,在PCR 反应循环中分子内退火形成稳定的“锅
柄结构”〔19〕而不被扩增。因此,SSH 技术通过二轮消减杂交和
抑制性PCR 特异扩增,使假阳性大大降低,提高了检出低丰度
靶mRNA 的灵敏度。
Hu 等〔21〕应用SSH 技术,结合反转录酶的模板切换(tem2
plate - switching) 功能, 以HCV RNA 阳性血清体外感染的人
MOLT- 4 急性淋巴母细胞白血病T 细胞系为模型,通过反转录
合成全长cDNA、抑制性消减杂交、消减的cDNA 文库构建、反相
斑点杂交筛选,在被筛的96 个克隆里,T- cDNA 探针杂交呈特
异阳性的16 克隆中,序列分析后得到4 个插入HCV 序列的
克隆。
2 非特异多重引导滚环式扩增法
乳头瘤病毒、痘病毒等,其基因物质为环状DNA 分子。在
事前未知基因序列的情况下,发现和鉴别这类病毒核酸序列还
可选择非特异多重引导滚环式扩增法(multiply primed rolling -
circle amplification ,RCA) ,扩增、分离、获取其基因片段供进一步
分析。
自然状况下,环状DNA 经常以滚环方式进行复制。Dean
等〔22〕应用随机6 聚核苷酸作引物,加入φ29 DNA 聚合酶,以质
粒DNA 和噬菌体DNA 为模型,建立了多重引物引导的滚环式
扩增法。φ29 DNA 聚合酶可长距离( > 70 000 nt) 地结合于DNA
模板,进行链置换DNA 合成。而随机6 聚核苷酸引物可多位
点的与单链环状DNA 互补复性。在φ29 DNA 聚合酶作用下,
以随机引物引导,合成与模板互补的DNA 链。当合成链延伸到
与模板结合的随机引物5′端时,在φ29 DNA 聚合酶的链置换活
性作用下,下游被延伸的随机引物链被“甩”出模板。而上游的
延伸链继续在环状模板上复制合成。同时,被从单链环状模板
上“甩”出的互补链,又成为新的模板,随机引物与之结合,在
φ29 DNA 聚合酶作用下,继续以枝杈的形式进行链延伸和链置
换,最后以双链DNA 串联体形式释放。用此法可使1 ng 纯
pCU18 环状DNA 模板延展式地扩增至107倍。
Rector 等〔23〕以此原理建立了不依赖已知的特定基因序列
(非序列依赖性) 的多重引导滚环式扩增环状DNA 病毒基因组
方法,并应用其扩增获取了HPV 16 的基因组DNA。在接近实
样的试验样品中,由于稀释倍数和环状DNA 分子较大等原因,
将HPV 16 基因组DNA 扩增了214 ×104 倍。
3 病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增
病毒核酸可包裹于病毒外壳内,病毒的蛋白外壳或脂膜对
病毒核酸具有保护作用。而病毒颗粒具有不同于细菌或其他
真核细胞的理化特性。利用这样的特点Allender 等〔24〕和Stang
等〔25〕各自建立了病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增
方法(sequence - independent amplification) 。两种方法的共同点在
于,依据病毒颗粒小、具一定密度,用0122μm 滤器过滤、或再串
上超速密度梯度离心,从样品中分离出病毒颗粒,DNA 酶酶解
游离的DNA ,裂解病毒颗粒,抽提获取较纯的病毒颗粒相关
核酸。
Allender 等〔24〕借鉴RDA 原理,对病毒颗粒相关核酸用限制
性内切酶酶切后,作非序列依赖性单引物PCR 扩增( sequence -
independent single primer amplification ,SISPA) :将抽提获取的DNA
或RNA 分别补齐,合成第二链DNA ,或反转录,合成双链cDNA。
限制性内切酶酶切后,酶切片段两端连接一种接头,并以与接
头同序列的单一寡核苷酸为引物,作PCR 扩增。扩增产物进一
步克隆与序列分析。用此法检验HBV 阳性血清和GBV - B 阳
性血清样品,结果在相当于106/ ml 个基因组拷贝浓度的50μl
样品中,可重复试验检出相应的病毒基因片段。
Stang 等〔25〕则在得到双链DNA 或双链cDNA 后加入k - 随
机引物,此种引物5′端含有20 个固定序列的核苷酸,3′端则有
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MNNMNM6 核苷酸随机简并序列。与变性模板退火时,6 核苷
酸随机简并序列随机地与模板相应序列互补退火,在T4 DNA
聚合酶作用下作链延伸。然后在延伸产物中加入k - 随机引物
中固定序列部分的20 寡核苷酸作引物,进行PCR 扩增。扩增
产物电泳分析、克隆、测序。用此方法检验由实时- PCR 定量,
包括病毒颗粒相关核酸及游离核酸在内的病毒基因组拷贝数
为109/ ml 的Cox - 3 和MAV - 1 培养物。前者的12 克隆中,
9 个克隆插入有肠道病毒的四个不同区域的同源基因片段;而
6 个MAV - 1 中分离的克隆内,5 个含有99 % 同源MAV - 1 基
因片段。
基于病毒颗粒分离纯化、DNase 处理、病毒颗粒相关核酸的
非序列依赖性PCR 扩增,获取、鉴定未知病毒的基因片段,尽管
灵敏度不够高,但其实验时间较短,步骤相对简单,对于病毒拷
贝数高,时间紧急的样品鉴别,是较适宜的一套方法。
病毒的种类、结构、特性多种多样,感染病毒后需要检验的
样品又各不相同,因此用于发现鉴别未知病毒的核酸序列的技
术,也不是固定不变和完全通用的。以上的技术方法各有优缺
点和适用范围。而针对扩增获取未知病毒基因组序列片断,这
一发现鉴定未知病毒的分子生物学技术的要点或瓶颈,必然还
会有新的改进、创新技术出现,将会更快、更灵敏、更简便、更准
确的发现鉴别未知病毒。
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生物论文

　　外来物种入侵的危害及其原因分析

　　我国地域辽阔，生态类型多种多样，涉及的外来入侵物种数量多、范围广，造成的危害也比较严重。
　　1 对生态环境的影响
　　外来入侵种通过竞争或占据本地物种生态位，排挤本地种。例如从洱海、程海和抚仙湖引进太湖新银鱼后鱼产量的变化来看，浮游动物为食性的银鱼不仅与本地鱼类的幼鱼发生强烈的食物竞争，而且与程海红鮊、大眼鲤、春鲤、洱海鲤、鱇[鱼良]白鱼等浮游动物食性的本地鱼类之间也产生强烈的食物竞争，导致本地鱼类种群数量急剧下降。
　　或与当地种竞争食物；或直接扼杀当地物种。外来鱼类通过与本地鱼竞争食物并吞噬本地鱼类鱼卵使本地鱼种类和数量减少的例子很多。以洱海为例，20世纪 60年代引进"四大家鱼"时带进的鰕虎鱼和麦穗鱼主要生活于湖泊的浅水区，嗜噬本地鱼类产于浅水区的授精卵，结果导致本地鱼类种群急剧减少。
　　或分泌释放化学物质，抑制其它物种生长，使当地物种的种类和数量减少，甚至濒危或灭绝。例如豚草可释放酚酸类、聚乙炔、倍半萜内脂及甾醇等化感物质，对禾本科、菊科等一年生草本植物有明显的抑制、排斥作用。
　　在云南各地，导致本地鱼类濒危的因素主要有四个：外来鱼类、围湖造田、水利工程、酷渔滥捕。滇西北主要的3个湖泊洱海、程海、泸沽湖，共有本地鱼类 34种。从鱼产量的历史资料来看，本地鱼类数量急剧下降均发生于引进新的鱼类种类之后。洱海在20世纪60年代初期引进"四大家鱼"时无意中夹带进鰕虎鱼和麦穗鱼等非经济性外来鱼类后，大理弓鱼等本地鱼类经历了第一次冲击，产量急剧下降，下降幅度在50~1000倍左右，同期鱼船的数量及捕捞强度的增加则仅为1倍左右；至80年代中期，鰕虎鱼和麦穗鱼等非经济性外来鱼类数量明显下降后，本地鱼类的产量又有所回升；80年代末期引进太湖新银鱼并在90年代初期形成产量后，土著鱼类又经历了第二次冲击，各种本地鱼类均陷于濒危状态。同期，泸沽湖有裂腹鱼遭受鰕虎鱼和麦穗鱼等排挤，程海有本地鱼遭受银鱼排挤的类似命运。这些资料表明，在外来鱼类、围湖造田、水利工程、酷渔滥捕等四大致危因素中，外来鱼类是导致土著鱼类种群数量急剧下降或濒危的最大因素。
　　由于直接减少了当地物种的种类和数量，形成了单优群落，间接地使依赖于这些物种生存的当地其它物种的种类和数量减少，最后导致生态系统单一和退化，改变或破坏当地的自然景观。有的入侵种，特别是藤本植物，可以完全破坏发育良好、层次丰富的森林。禾草或灌木入侵种占据空间后，其它的乔木就无法生长。许多外来入侵种使植被遭到破坏，变成层次单一的低矮植被类型。这些植物群落（包括物种组成和空间结构等）的改变相应地引起生态过程的改变，这包括正常的火循环周期被改变，火发生的频率及水资源的消耗增加，加重土壤的贫瘠化等。
　　外来入侵种对生态系统另外一个更不易察觉的影响是污染当地的遗传多样性。随着生境片段化，残存的次生植被常被入侵种分割、包围和渗透，使本土生物种群进一步破碎化，造成一些植被的近亲繁殖及遗传漂变。有些入侵种可与同属近缘种、甚至不同属的种（如加拿大一枝黄花（Solidago canadensis）不但可与同属植物杂交，还可与假蓍紫菀（Aster ptarmicoides）杂交。入侵种与本地种的基因交流可能导致后者的遗传侵蚀。在植被恢复中将外来种与近缘本地种混植，如在华北和东北本地种落叶松（Larix）产区种植日本落叶松（eri），在海南本地的海桑属（Sonneratia）产区混植从孟加拉国引进的无瓣海桑（S. apetala），都存在相关问题，因为这些属已有一些种间杂交的报道[14]。从美国引进的红鲍（Haliotis rufescens）和绿鲍（H. fulgens），在一定条件下能和我国本地种皱纹盘鲍（H. dscus hannai）杂交，在实验室条件下已经获得了杂交后代，如果这样的杂交后代在自然条件下再成熟繁殖，与本地种更易杂交，结果必将对我国的遗传资源造成污染[3]。

　　值得注意的是，与人类对环境的破坏不同，外来入侵物种对生态系统的破坏及威胁是长期的、持久的。当人类停止对某一环境的污染后，该环境会逐渐恢复，而当外来物种入侵后，即使停止继续引入，已传入的个体并不会自动消失，而会继续大肆繁殖和扩散，这时要控制或清除往往十分困难。而由于外来物种的排斥、竞争导致灭绝的本地特有物种则是不可恢复的。因而对外来物种威胁生物多样性的问题应引起足够的重视。

　　2 对人类健康的影响
　　全球经济一体化带来了许多新的医学问题，其中一些是外来物种入侵所带来的。病毒是个棘手的问题，尽管人类用疫苗成功地防治了天花、小儿麻痹、黄热病等病毒，但是对大量的病毒却束手无策。人类花费大量精力寻找爱滋病的疗法，却收效甚微。更糟糕的是，全球化会使那些对人类有害的病毒影响范围进一步扩大。传染性疾病是外来物种入侵的典型例证。大凡新型的传染病，一些是直接通过旅行者无意带进来的，还有一些则是间接地从人们有意或无意引进的动物体上传染的。[10]
　　淋巴腺鼠疫（通常是由鼠疫杆菌Pasturella pestis引发的）由跳蚤携带，而跳蚤通过寄生于入侵物种--原产自印度的黑家鼠（Rattus rattus），从中亚传播到北非、欧洲和中国[10]。
　　随着欧洲殖民地的建立，麻疹和天花从欧洲大陆席卷了西半球。当地居民对这些疾病的抵抗力很弱，这也促使了阿芝特克和印加帝国的衰落[10]。
　　一些外来动物，如大瓶螺等，是人畜共患的寄生虫病的中间宿主。麝鼠可传播野兔热，极易威胁周围居民的健康。
　　豚草花粉是人类变态反应症的主要病原之一，所引起的"枯草热"给全世界很多国家人们的健康带来了极大的危害。据调查，1983年沈阳市人群发病率达 1.52%，每到豚草开花散粉季节，过敏体质者便发生哮喘、打喷嚏、流清水样鼻涕等症状，体质弱者甚至可发生其他合并症并死亡[1]。
　　大型工程，比如修建水坝、灌溉、土地开垦、道路建设和移民工程等，都可能导致疾病入侵，比如疟疾、骨痛热、血吸虫病和锥形虫病。人类开垦热带雨林地区，为更多的病毒入侵提供了新的机会，其中包括以前只在野生动物寄主之间循环的出血性发烧病的病毒。

　　3 对社会和文化的影响
　　外来入侵物种通过改变侵入地的自然生态系统，降低物种多样性，从而严重危害当地的社会和文化。我国是一个多民族国家，各民族聚居地区周围都有其特殊的动植物资源和各具特色的生态系统，对当地特殊的民族文化和生活方式的形成具有重要作用，特别是傣族、苗族、布依族等民族地区。由于紫茎泽兰等外来入侵植物不断竞争，取代本地植物资源，生物入侵正在无声地削弱民族文化的根基。凤眼莲往往大面积覆盖河道、湖泊、水库和池塘等水体，影响周围居民和牲畜生活用水，人们难以从水路乘船外出。

　　4 对经济发展的影响
　　外来入侵物种对人类的经济活动也有许多不利影响。杂草使作物减产，增加控制成本；水源涵养区和淡水水源生态体系质量的下降会减少水的供应；旅游者无意中带入国家公园的外来物种，破坏了公园的生态体系，增加了管理成本；病菌传播范围的不断扩大，导致每年上百万人致死或致残。外来入侵种给人类带来的危害是巨大的，造成的损失也是显而易见的。
　　美国已有5万多种外来种，虽然有害的入侵种只占其中一小部分，但它们造成的负面影响却是惊人的。美国每年有700 000 hm2 的野生生物栖息地被外来杂草侵占，每年由于入侵种造成的经济损失达1 230亿美元！在美国受威胁和濒危的958个本地种中，有约400种主要由于外来种的竞争或危害而造成的，这种损失是难以用货币来计算的。入侵种给中国造成的损害尚未做出全面的评估。由于中国的生态环境破坏得更为严重，入侵种更为猖獗，加上本土物种的基数较大，估计受损程度要大于美国。入侵种已成为我国经济发展、生物多样性及环境保护的一个重要制约因素。保守估计，外来种每年给我国的经济造成数千亿元的经济损失。表2部分地显示了外来入侵种相关的经济花费。

　　表2：我国外来入侵种相关的经济损失和防治费用

　　外来入侵动植物对农田、园艺、草坪、森林、畜牧、水产和建筑等都可能直接带来经济危害。比如，外来的白蚁是破坏建筑的重要因素。因此，在国际贸易活动中，外来种常常引起国与国之间的贸易摩擦，成为贸易制裁的重要借口或手段。
　　外来有害生物还可以通过影响生态系统而给旅游业带来损失。在云南省昆明市，20世纪70-80年代建成了大观河篆塘处-滇池-西山的理想水上旅游线路，游人可以从市内乘船游滇池和西山。但自90年代初，大观河和滇池中的凤眼莲"疯长"成灾，覆盖了整个大观河以及部分滇池水面，致使这条旅游线路被迫取消，在大观河两侧建设的配套旅游设施只好废弃或改做他用，大观河也改建成地下河。这给昆明的旅游业造成了巨大的损失。松材线虫扩展速度惊人，现在正威胁着著名的黄山和张家界的风景名胜区。一旦入侵，给这些风景区带来的经济损失将是很难估量的[1]。
　　与直接经济损失相比，间接损失的计算十分困难。外来生物通过改变生态系统所带来的一系列火灾、水土、气候等不良影响从而产生的间接经济损失是巨大的。比如，大量的凤眼莲植株死亡后与泥沙混合沉积水底，抬高河床，使很多河道、池塘、湖泊逐渐出现了沼泽化，甚至失去了其应有的生态作用，并对周围气候和自然景观产生不利影响，加剧了旱灾、水灾的危害程度。凤眼莲植株大量吸附重金属等有毒物质，死亡后沉入水底，对水体二次污染，又加剧了污染程度。尽管这些损失难以准确计算，但却不容忽视。

Nature｜SARS-CoV-2的病毒拯救

反向遗传学 被认为是一种不可或缺的工具，它彻底改变了我们对病毒发病机制和疫苗开发的认识。大型的RNA病毒基因组，如冠状病毒基因组，由于基因组较大且不稳定，很难在大肠杆菌宿主中克隆和操作。

两位通讯作者均来自瑞士的University of Bern

Transformation-Associated Recombination cloning  TAR克隆

基因组DNA片段和过量的TAR载体在去除细胞壁的酵母细胞中进行混合。每个载体中都含有对目的基因特异的两段序列（标为蓝色和红色）以及酵母的筛选标记HIS3和CEN6（淡蓝色原点）。由于载体过量，酵母细胞便会将DNA片段全部接受。根据具体情况又可分为三类：1）未分到基因组DNA的；2）分到基因组DNA但未被整合到TAR载体上的；3）分到基因组DNA且通过自身同源重组被整合到TAR载体上的。显然我们是只需要第三种情况的阳性克隆，怎么把其它两种过滤掉呢？答案是进行电泳。

下图是对上述过程的简化示意：

2010年5月20日，J. Craig Venter Institute在美国 Science  杂志上报道了首例人造细胞的诞生。向山羊支原体  Mycoplasma capricolum  细胞中转入人工合成的蕈状支原体 Mycoplasma mycoides  的基因组而来，产生的人造细胞表现出的是蕈状支原体的生命特性。

利用该平台，研究人员在拿到合成DNA片段后一周内，对新冠病毒进行了基因组改造和病毒拯救。研究团队于1月14日向试剂公司下单，以化学合成方式得到上述14个DNA片段，并在2月4日拿到其中的12个含片段载体（有pUC57、pUC19、pUC57mini和PCC1-His3）。其中片段5 和7 未获得，原因不详。研究团队最终通过对一位来自慕尼黑患者的新冠病毒样本（BetaCoV/Germany/BavPat/2020）进行RT-PCR 扩增，获得了第5和第7个片段。

利用TAR 克隆，研究人员获得了6 组正确组装的新冠病毒构建体的分子克隆。随后用酵母的同源重组系统依据末端重复的序列将这些DNA 序列拼到一起。获得完整的病毒序列后，用T7 RNA 聚合酶将其通过脱落转录，得到病毒RNA，将该RNA 用电穿孔技术导入到非洲绿猴肾细胞（VeroE6 cell）中，使其感染。将用于培养绿猴肾细胞（~2d），含释放出的病毒颗粒的上清液注入到别的培养基中，发现可以感染别的细胞，说明新构建的酵母合成平台可以拯救病毒。

同理，作者团队在鼠肝炎病毒A59（MHV-A59）和MERS-CoV进行病毒拯救的测试，发现效果依旧很好，测试的克隆中正确组装了病毒基因组的YAC均可达到90％，这表明病毒在酵母中的组装效率相当之高。

TAR 克隆系统的一个最重要的优点就是可以先对全基因组进行设计，通过对小的具有重复序列的片段的合成，进而再依靠酵母的同源重组系统进行片段的正确组装，极大的降低了合成的难度，也大幅提高了合成的效率。无需得到变异毒株的临床样本，通过对病毒变异的分析，可以合成构建出该变异毒株的基因组片段，再通过酵母平台进行重建与拯救。论文中还提到对局部片段的重新设计，以测试改变前后对病毒的影响。

总的来说，这一方法即利用酵母人工染色体在酵母体内将合成的SARS-CoV-2的DNA片段进行体外重组，获得全长cDNA克隆。再将cDNA体外转录为RNA，利用电穿孔将病毒RNA转染进哺乳动物细胞，实现病毒拯救。

化学合成的基因组DNA所产生的SARS-CoV-2可以绕开病毒分离物的来源限制，而且还可以对单个基因进行遗传修饰和功能表征。

对于这一篇论文，我起初有许多地方不明白。

首先是病毒的基因组合成，理论上讲，比病毒更高级的生物基因组，并不是没有人合成出来过，因此这篇论文的技术可以说是降维打击了，那为什么还可以发表在顶级杂志 Nature 上呢？

从时间线上进行分析，我们可以得知，1月11日病毒序列正式被公布（据我所知应该是中国CDC发布的），但是国外第一个提取出病毒毒株的时间却是到了2月26日，与序列的公布整整相差1个多月。我们也可以知道这次的Pandemic，一个多月可以新增多少感染者和死亡者，时间就是生命啊！而作者在序列公布后的第3天便下出了订单，在ICTV正式公布新冠病毒名称的第2天便得到了拯救完成的病毒。可以想象，如果以后没有可能及时得到病毒的毒株，我们可以直接根据序列得到病毒的毒株， 这是本篇文章最大的亮点之一，即在此类形势下给人一种研究病毒的范式。

第二个亮点，可以关注到作者不仅做了SARS-CoV-2，还做了MHV和MARS-CoV。看不明白的话给个提示：这三种病毒都是冠状病毒科（Coronaviridae ）的！此外，作者在表格中还列出未实现拯救的人呼吸道合胞病毒（hRSV-B）、寨卡病毒（ZIKA virus）和流感病毒（HCoV）。这意味着作者想 通过对一系列冠状病毒的拯救验证来说明这一平台广泛的适用性 ，将难缠的冠状病毒，乃至其他病毒的毒株获取难度降低。这或许对科学界是件好事，但是可能也是件坏事吧…

Craig Ventor；冠状病毒亚基因组；

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[1] Thao, et al.  Nature  , 2020. 

[2] Natalay Kouprina & Vladimir Larionov.  Nat Protocol  , 2008.

[3] Daniel G. Gibson, et al.  Science  , 2010. 

[4] 孙明伟, 李寅, 高福.  生物工程学报  , 2010.

病毒和它引起的疾病论文

病毒（Virus)由一种核酸分子（DNA或RNA）与蛋白质（Protein）构成或仅由蛋白质构成（如朊病毒）。病毒个体微小，结构简单。病毒没有细胞结构，由于没有实现新陈代谢所必需的基本系统，所以病毒自身不能复制。但是当它接触到宿主细胞时，便脱去蛋白质外套，它的核酸（基因）侵入宿主细胞内，借助后者的复制系统，按照病毒基因的指令复制新的病毒。
目前，科学界公认的对病毒的定义是只能在活着的宿主细胞内复制的感染源。
有一些病毒能诱发良性肿瘤，如痘病毒科的兔纤维瘤病毒、人传染性软疣病毒和乳多泡病毒科的乳头瘤病毒；另有一些能诱发恶性肿瘤，按其核酸种类可分为DNA肿瘤病毒和RNA肿瘤病毒。DNA肿瘤病毒包括乳多泡病毒料的SV40和多瘤病毒，以及腺病毒科和疱疹病毒科的某些成员，从肿瘤细胞中可查出病毒核酸或其片段和病毒编码的蛋白，但一般没有完整的病毒粒。RNA肿瘤病毒均属反录病毒科，包括鸡和小鼠的白血病和肉瘤病毒，从肿瘤细胞中可查到病毒粒。这两类病毒均能在体外转化细胞。在人类肿瘤中，已证明EB病毒与伯基特淋巴瘤和鼻咽癌有密切关系；从一种T细胞白血病查到反录病毒。此外，Ⅱ型疱疹病毒可能与宫颈癌病因有关，乙型肝炎病毒可能与肝癌病因有关。但是，病毒大概不是唯一的病因，环境和遗传因素可能起协同作用。
病毒感染常发生在感冒等上呼吸道感染后，病毒颗粒可由血循环直接进入内耳血循环中，引起耳蜗毛细胞、神经节细胞及微血管等结构的破坏。病毒亦可经圆窗侵入内耳，引起迷路炎等病损，引起耳聋。