毕业论文开题报告范文免费样本

毕业论文开题报告范文免费样本

　　开题 报告 作为 毕业 论文答辩委员会对学生答辩资格审查的依据材料之一,是论文写作或研究能否按计划实施和开展的重要保证。下面是我为大家整理的毕业论文开题报告模板以及 范文 ，希望你们喜欢。
　　毕业论文开题报告模板
　　第一步、论文拟研究解决的问题

　　内容要求：

　　明确提出论文所要解决的具体学术问题，也就是论文拟定的创新点。

　　明确指 出国 内外文献就这一问题已经提出的观点、结论、解决 方法 、阶段性成果……

　　评述上述文献研究成果的不足。

　　提出你的论文准备论证的观点或解决方法，简述初步理由。

　　撰写方法：

　　你的观点或方法正是需要通过论文研究撰写所要论证的核心内容，提出和论证它是论文的目的和任务，因而并不是定论，研究中可能推翻，也可能得不出结果。开题报告的目的就是要请专家帮助判断你所提出的问题是否值得研究，你准备论证的观点方法是否能够研究出来。

　　一般提出3或4个问题，可以是一个大问题下的几个子问题，也可以是几个并行的相关问题。

　　第二步、国内外研究现状

　　内容要求：列举与论文拟研究解决的问题密切相关的前沿文献。基于“论文拟研究解决的问题”提出，允许有部分内容重复。

　　撰写方法：只简单评述与论文拟研究解决的问题密切相关的前沿文献，其他相关文献评述则在文献综述中评述。

　　第三步、论文研究的目的与意义

　　内容要求：

　　简介论文所研究问题的基本概念和背景。

　　简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题。

　　简单阐述如果解决上述问题在学术上的推进或作用。

　　基于“论文拟研究解决的问题”提出，允许有所重复。

　　第四步、论文研究主要内容

　　容要求：初步提出整个论文的写作大纲或内容结构。由此更能理解“论文拟研究解决的问题”不同于论文主要内容，而是论文的目的与核心。
　　关于格式的论文范文
　　现代汉语“X什么X”格式的语义分析

　　摘要：“X什么X”格式是现代汉语口语中常见的一种句式，如我们常说和常听到的“看什么看”“笑什么笑”“挤什么挤”等等。能够进入该格式的“X”可以是动词、形容词、名词等等。本文拟从语义来源及构式义等角度来进行探讨。

　　关键词：“X什么X”格式 语义 分析

　　“X什么X”格式是现代汉语口语中常见的一种句式，对其进行语义分析具有重要意义。

　　一、“X什么X”格式的语义来源

　　关于“X什么X”格式的基本语义特征，一般认为是表否定，具体 句子 有一些具体的语义特点，如不满、责骂等。但是对该语义的来源，主要有两种说法：一是由疑问代词“什么”的非疑问用法(否定用法)带来的，其中的“什么”前指X，后一个X主要强调主观抒发，突出感情色彩;二是由整个结构表达。但本文认为：

　　(1)如果说该格式意义是由疑问代词“什么”的否定用法带来的话，那么，当X为V时，动词重叠式的意义主要用来“表现时量小、动量短或委婉态或尝试态”，而“V什么V”格式表示的显然不是对“时量小、动量短或委婉态或尝试态”的否定。

　　(2)“什么”本身是没有否定意义的，它的这种用法是一种语用否定形式，而非句法层面上的否定，是人们在言语交谈中为表现主观性而采取的一种语法化形式。(肖任飞、张芳，2006)并且用“什么”进行否定的意义并不单一，在一定的情况下，这种否定意义的表达需要语境的帮助。如：

　　a、“不是告诉你了吗……;挤什么挤，要买快说……”

　　b、挤什么挤?”

　　a、b中的“挤什么挤”分别表示的是不耐烦和愤怒的情绪。

　　(3)表否定的“X什么X”格式具有泛形化的特点，除了本文讨论情况外，还有以下形式：

　　a、“光杆的‘什么’”表否定，如“什么呀!我才不生气呢!”

　　b、“什么+Y(Y可以是一个词或一个 短语 )”如“什么他真能干!”

　　c、“X+什么”，如“怕什么，我还能吃了你!”

　　d、“X什么Y”形式，其中的Y可以是NP、VP或AP形式，如“担什么心”“有什么依不得”“发什么呆呀”等。这些格式都是带上疑问代词“什么”表示否定的格式，但是它们的内部解释机制不同。

　　(4)“X什么X”格式还可以受状语修饰，如“还装什么装、还等什么等”，这里的“还”是修饰“X什么X”整个格式的，并不是修饰其中的某个组成成分。

　　因此，本文认为“X什X” 格式的否定意义是由整个格式带来的。以下本文将以构式语法理论为基础，对“X什么X”格式的构式义进行相关的分析。

　　根据以上论述，我们可以认为判断构式的标准为：一是构式的语义不可从其组成成分推导出来;二是构式的语义也不能从已有的句式中推导出来。而上面我们已经解释了用“疑问代词的非疑问用法或否定用法”来解释“X什么X”格式的否定意义是行不通的。另外我们都知道，在语言系统中，语法意义和语法功能完全相同的语法结构最终难以共存，一种语法形式能够在语言系统中存在，在言语交际中传承，必然有其独特的价值。而“X什么X”格式是现代汉语口语中常见的一种句式，是一种在言语交际中成熟和发展起来的语法化形式。因此本文认为，“X什么X”格式是一种构式，其否定用法是由整个格式来表达的。

　　二、“X什么X”格式的构式义

　　在“X什么X”格式的句法分析中，我们已经分析了，该格式中的“X”可以是动词、形容词、名词等语法类别，下面本文将分析该格式的构式义。

　　“X什么X”格式的基本语义是表否定，但是具体的句子又有自己的一些语义。先看以下例子：

　　(1)胖胖大大的钱康从车上喝道而下：“挤什么挤?先下后上!”(北大CCL 语料库)

　　(2)李文彬却不识眼色，梗着脖子说：“老窦，你也太心虚了，你怕什么怕?……”(同上)

　　(3)甲：这次这事真是太谢谢你了!

　　乙：谢什么谢!举手之劳。(生活实例)

　　(4)“好什么好?都是‘鸿门宴’，不是那么好吃的。”(北大CCL语料库)

　　(5)窦夫人：“我又不是吃你，你急什么急!”(白先勇《游园惊梦》)

　　通过观察，我们不难发现，当X性质不同时，该格式的具体意义是不同的。

　　A、“X什么X”格式在句式上相当于一个否定陈述句。

　　1)当X为动词时，该格式表示否定X所表示的动作或行为。如(1)中听话人认为说话人不知道原因，是对说话人所表示的指导这种行为的否定，并试图劝导说话人不要多管闲事。这类动词多为“懂、了解、明白”等心理感官动词。 (2)(4)表示的也是这样一种语义，是对说活人所说的否定。

　　2)当X为形容词时，该句式否定性质状态，在句式上也相当于一个否定陈述，如(5)(8)中听话人对说话人所说的“好”“年轻”的状态的否定，在意义上是“不好”“不年轻”。

　　B、“X什么X”格式在句式上相当于一个祈使句。

　　1)当X为动词(V)时，否定动作行为，该格式在句式上相当于一个表示禁止或拒绝的祈使句。如(2)(5)中的“挤什么挤”“谢什么谢”表示的就是“不要挤”“不用谢”的意思，表示的都是说话者对“挤”和“谢”这一动作行为的阻止，只是在语用意义上，后者表示了一种谦逊、客气的情感。

　　2)当X为形容词(A)时，也是否定性质或状态，只是在句式上相当于一个表示禁止或拒绝的祈使句。如(7)中是窦夫人对听话人所表示出来的状态的否定，在语义上相当于“别急”。

　　3)当X为名词、副词或叹词时，该格式在语义上或相当于否定陈述句，或相当于否定祈使句，如“酒什么酒”“你什么你”“都什么都”“啊什么啊”在语义上表示的都是对说话人所发出的动作行为的否定。

　　通过以上分析，我们可以概括出“X什么X”格式的构式义：在一定的语境中，说话者对某种动作、行为或性质状态的主观否定。

　　参考文献：

　　[1]高宁.V什么V格式研究[D].吉林大学，2009(4).

　　[2]黄喜宏.“什么”的否定用法研究[J].上海师范大学，2008(4).

　　[3]孙蕾.论“什么”反诘句的表达形式及其深层语义特征[J].语文学刊，2009(10).

　　[4]朱锡明.口语中的“X什么”与“X什么X”句式[J].广西社会科学，2005(9).

　　
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大学毕业论文开题报告怎么写

　　开题报告怎么写

　　一、课题开题报告含义与作用

　　开题报告， 就是当课题方向确定之后，课题负责人在调查研究的基础上撰写的报请上级 批准的选题计划。 它主要说明这个课题应该进行研究，自己有条件进行研究以及准备如何开 展研究等问题， 也可以说是对课题的论证和设计。开题报告是提高选题质量和水平的重要环节。

　　二、开题报告的结构与写法

　　开题报告主要包括以下几个方面：

　　(一)课题名称

　　(二)课题研究的目的、意义

　　(三)国内外研究现状、水平和发展趋势。就是本课题有没有人研究，研究达到什么水平， 存在什么不足以及正在向什么方向发展等。开题报告写这些内容一方面可以论证本课题 研究的地位和价值， 另一方面也说明课题研究人员对本课题研究是否有较好的把握。我们进行任何科学研究，必须对该问题的研究现状有清醒的了解，这在第一部分已经谈到。

　　(四)课题研究的理论依据。我们现在进行的课题基本上都是应用研究和发展研究，这就要求我们的研究必须有一些基本的理论依据来保证研究的科学性。比如： 我们要进行活动课实验研究，我们就必须以课程理论、学习心理理论、教育心理学理论为研究试验的理论依据。我们进行教学模式创新实验，就必须以教学理论、教育实验理论等为理论依据。

　　(五)课题主要研究内容、方法

　　(六)研究工作的步骤

　　(七)课题参加人员的组成和专长。主要看参加人员的整体素质与水平，尤其是课题负责人的水平怎么样。如果参加人员和负责人既没有理论又没有实践经验， 这个课题就无法很 好地完成，也就无法批准立项。

　　(八)现有基础。主要是人员基础和物质基础。很多课题对人员和设备方面要求是比较高的，如果基本的研究条件都没有，这个课题同样不能立项。

　　(九)经费估算。就是课题在哪些方面要用钱，用多少钱，怎么管理等。

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毕业论文的开题报告范文
　　随着现代信息技术的迅猛发展，网络技术在教育中的应用日益广泛和深入，特别是Internet与校园网的接轨，为中小学教育提供了丰富的资源，使网络教学真正成为现实，同时也为中小学教育开辟了广阔的前景。陈至立部长在全国中小学信息技术教育工作会议上指出：“全国实施中小学'校校通'工程，努力实现基础教育的跨越式发展。”“‘校校通’工程的目标是用5年到10年时间，加强信息基础设施和信息资源建设，使全国90%左右独立建制的中小学校能够上网，使中小学师生都能共享网上资源，提高中小学的教育教学质量。”“校校通”工程的启动和发展，给中小学教学带来革新的机会，为学科教学信息化奠定了物质基础。如何有效地利用网上的资源，建构基于网络的现代教学模式是一个迫切研究的问题，而开展网络教学模式研究的重要理论基础之一就是网络教学的设计与评价。因此，开展网络教学的设计与评价的探索与实践研究有着十分重要的意义。

　　一、课题研究背景

　　（一）国内外的研究现状

1、网络教学的设计理论与方法的研究缺乏系统性

　　通过对国内外有关的学术刊物（如《电化教育研究》、《中国电化教育》、《Educational Technology》等）、教育网站和国际国内有关学术会议（GCCCE、ICCE、CBE等）的论文集进行分析，网络教学的设计研究主要是关于建构主义学习环境的设计和协作学习的设计等方面，缺乏系统的研究。可以说，网络教学的设计理论的研究还处于初级阶段，还有很多问题需要去研究和探索。例如，在网络环境下如何利用网络资源进行主动学习、利用虚拟情境进行探究学习、利用通讯工具进行协商学习、利用工具进行创造学习的设计以及教师指导性活动的设计等方面，都值得我们去研究。

2、网络教学的评价研究才刚刚起步

　　随着Internet应用的普及，网络教学已成为一种重要的教学手段和教学场所。然而，与传统教学相比，网络教学的质量保证体系却显得不够完善、健全。如何保证网络教学的质量，建立一个行之有效的网络教学评价模型，已成为网络教学研究的一个重要课题。时至2000年，教育部批准全国31所高校建立网络教育学院，但却没有制定出如何保证网络教育质量的相关政策。美国国家教育政策研究所（The Institute For Higher Education Policy）于2000年4月也发表了一份名为"在线教育质量：远程互联网教育成功应用的标准"的报告，然而，这些文章（报告）也仅仅是描述性的定义网络教学的评价指标，而对如何组织评价、如何获取定量数据、评价数据如何促进教学等方面则很少涉及。目前，网络教学的支撑平台中的学习评价模块往往只含有测试部分，而缺乏相应的分析与反馈。

　　（二）课题研究的意义

1、促进网络教学的发展，提高网络教学的质量

　　由于网络教学可以实现信息资源共享，在网上组织最优秀的教材和教法，使学习者在网上可以学到最新的知识，因此是教学改革发展的方向。通过本项目的研究与实践，使网络教学更能为学习者提供一个建构主义的学习环境，充分体现学生的首创精神，学生有更多的机会在不同情境下去运用他们所学的知识，而且学生可以根据自身的行动的反馈来形成对客观事物的认识和解决实际问题的方案，从而提供网络教学的质量。

2、寻找利用计算机技术和网络技术实现学生远程交互自主学习的教学设计的技术解决方案

3、完善和发展教学设计理论

　　网络环境下的教学与传统教学，不仅是教学环境的不同，在教学内容、教学手段、教学传播形式上都有本质的区别。通过本项目的研究，能够解决网络环境下，教学如何进行教学设计，如何调控教学过程，如何有效实施教学活动以达成教学目标，是对教学设计理论的完善和发展。

　　二、课题研究内容

　　（一）研究的主要内容

1、网络教学设计理论体系的研究

　　包括教学目标的设计、建构性学习环境的设计、学习情境的设计、学习资源的设计、学生自主学习活动的设计、学生协作学习活动的设计、教师指导性活动的设计、学习评价工具的设计等。

2、基于网络环境下的教学策略与教学模式的研究

　　（1）网络教学策略的研究，如网络环境下的教学内容组织策略、网络环境下的教学情景营造策略、网络环境下的教学对话组织策略、网络环境下的的课堂管理策略等

　　（2）网络教学模式的研究，如项目化学习模式、探索性学习模式、研究性学习模式等

3、网络教学评价的内容体系、方法、步骤与模型的研究

4、网络教学设计系统软件的开发与应用

5、网络教学评价系统软件的开发与应用

　　根据上述研究内容，总课题下设如下子课题：

1、网络教学设计与教学评价的理论研究（谢幼如、李克东）

2、网络教学资源的开发（邓文新）

3、网络教学设计与教学评价系统的开发（柯清超）

4、Web课程的教学过程设计及支持系统的研究（陈品德）

5、网络教学设计与教学评价理论的应用研究（余红）

　　（二）课题的研究目标

　　本项目的研究目标是：运用现代教学理论与建构主义学习理论，通过教学改革与实验，探索网络教学的设计与评价的理论和方法，开发相配套的网络教学的设计和评价系统软件，探索普通中小学利用网络资源进行网络教学的途径与方法。

　　（三）预期成果形式

1、论文与专著

　　发表有关网络教学的设计与评价的一系列学术论文，出版专著《网络教学的设计与评价》。

2、电脑软件

　　开发《网络教学设计系统软件》和《网络教学评价系统软件》，制作《网络教学设计》专题教学（学习）网站，建立《教学设计》多媒体资源库。

　　三、研究方法与技术路线

　　（一）研究方法与步骤

　　本项目的研究主要采用行动研究、实验研究、评价研究等方法。

　　对于较大规模的教学设计与教学模式的试验研究，将采用行动研究方法。

　　对于个别带有创新性的，能提出重要见解的小范围的教学研究，则通过建立科学的假设，采用实验研究的方法。

　　关于教学模式的评价和有关教学效果的分析，则采用评价研究方法。

　　研究步骤如下：

2002年5月-2002年8月，收集资料，建立模型

2002年9月-2003年1月，开发软件

2004年2月-2004年8月，教学试验，评价修改

2005年9月-2005年12月，扩大试验，归纳总结

　　（二）关键技术

1、基于网络的协作化设计思维工具的通讯模型的构建；

2、教学设计系统中师生教学活动的可视化表示与分析；

3、网络教学的教学评价模型的构建；

4、网络教学过程中学习反应信息的自动采集与处理。

　　四、课题研究价值

　　（一）创新点

1、建立网络教学设计的理论体系与方法。

2、建立基于网络环境的各类教学评价指标体系。

3、开发出操作性

　　强、具有实际应用价值的网络教学的设计工具和评价系统软件。

　　（二）理论意义

　　传统的教学设计是应用系统方法分析和研究教学的问题和需求，确立解决他们的方法与步骤，并对教学结果作出评价的一种计划过程与操作程序。现代教学设计理论已经不拘泥于系统论的理论基础，不强调对教学活动的绝对控制，逐渐放弃呆板的设计模式，开始强调教学设计的关系性、灵活性和实时性，从而更加有利于学生的创新精神和实践能力。本课题的理论成果将完善和发展传统的教学设计理论与方法。

　　（三）应用价值

1、通过课题的研究与实践，总结并形成基于网络环境下学科教学设计的理论与方法，优化中小学课堂教学结构。

2、通过课题的研究与实践，探索并总结信息化时代如何改革传统的思想和模式，使学生学会利用网络资源进行学习的方法和经验。

3、通过课题的研究与实践，探索普通中小学利用网络资源的途径与方法，形成一批优秀的网络教学课例。

4、通过课题的研究与实践，开发出具有应用推广价值的网络教学的设计工具和评价系统软件。

　　五、研究基础

　　（一）已有相关成果

1、曾于93年、97年两度获得国家级优秀教学成果奖，其中《多媒体组合教学设计的理论与实践》项目的成果在全国的大中小学广泛应用，《多媒体组合教学设计》（李克东、谢幼如编著，科学出版社）多次再版发行。

2、出版的《多媒体教学软件设计》（含教材与光碟）（谢幼如等编著，电子工业出版社，1999年）、《多媒体教学软件设计与制作》（含教材与光碟）（李克东、谢幼如、柯清超编著，中央广播电视大学出版社，2000年）和《信息技术与学科教学整合》（李克东、谢幼如、柯清超等，万方数据电子出版社，2001年）在全国广泛应用。

3、97年《多媒体技术在基础教育改革中的应用实验研究》和《小学语文"四结合"教学改革试验研究》获国家教委全国师范院校面向基础教育改革科学研究优秀成果二等奖。

4、承担国家"九五"重点科技攻关项目《计算机辅助教学软件研制开发与应用》（简称96-750）《小学语文科学小品文》、《小学语文古诗欣赏》、《小学语文扩展阅读》、《初中语文新诗赏析》四个子课题的研制与开发，4个项目6张光盘全部通过教育部组织的专家组鉴定，被评为优秀软件，并由北京师范大学出版社和电子工业出版社出版，在国内及东南亚地区发行。

5、2000年所完成的《学习反应信息分析系统》获广东省高等学校优秀多媒体教学软件一等奖，并出版专著《学习反应信息的处理方法与应用》（谢幼如、李克东著，暨南大学出版社，1999年）。

　　（二）研究条件

　　华南师范大学教育技术学科是国家级重点学科，华南师范大学教育信息技术学院是"211工程"重点建设学科单位，我国的教育技术学博士点之一。华南师范大学教育技术研究所拥有从事计算机教育应用研究的人员近30名，其中包括教授2名、副教授5名、讲师8名、博士研究生4名和硕士研究生近15名。他们在长期的研究工作中，对各种多媒体教学软件、网络教学应用软件、学科教学工具、资源库管理应用系统进行了深入的研究与探索，并已取得了实质性的进展和成果。本研究所拥有先进的计算机软件开发实验室两个、国家级的多媒体教学软件制作基地一个，在国内教育技术领域方面处于领先地位。

　　（三）参考文献

1、《多媒体组合教学设计》，李克东、谢幼如编著，科学出版社，1992年第一版、1994年第二版

2、《多媒体教学软件设计》谢幼如等编著，电子工业出版社，1999年

3、《信息技术与学科教学整合》，李克东、谢幼如主编，万方数据电子出版社，2001年

4、《学习反应信息的处理方法与应用》，谢幼如、李克东著，暨南大学出版社，1999年

5、《Global Education On the Net》，高等教育出版社、Springer 出版社，1999年

6、《教学设计原理》，R.M.加涅、L.J.布里格斯、W.W.韦杰著，华东师范大学出版社，1999年

7、《新型教学模式的探索》，谢幼如编著，北京师范大学出版社，1998年

8、全球华人计算机教育应用大会（GCCCE）第一届至第五届论文集，1997年（广州）、1998年（香港）、1999年（澳门）、2000年（新加坡）、2001年（台北）

9、《改善学习--2001中小学信息技术教育国际研讨会论文选编》，吉林教育出版社，2001年

10、《认知过程的评估》，J.P.戴斯、J.A.纳格利尔里、J.R.柯尔比著，华东师范大学出版社，1999年

11、《教育技术学研究方法》，李克东编著，北京师范大学出版社，2002年

　　六、研究组织机构

　　本课题的研究人员由教学设计专家、信息技术教育应用专家、网络技术专家、学科教学专家、中小学教师、教育技术研究人员与研究生组成，以大学的教育技术研究所为核心，主要以广东、江苏、浙江、福建等地区的部分中小学以及西部一些网络环境较好的中小学为研究基地，辐射其他地区的中小学，借助信息技术产业的技术力量，实现理论、技术与学科教学的优化整合。

　　总课题组顾问：南国农教授（我国著名电化教育专家，西北师范大学）

　　李运林教授（华南师范大学电化教育系原系主任）

　　周君达教授（中央电化教育馆原副馆长）

　　苏式冬教授（广东教育学院原副院长）

　　许汉特级教师（广州市教研室）

　　总课题组组长：谢幼如教授（华南师范大学教育技术研究所）

　　李克东教授（华南师范大学教育技术研究所所长、博士生导师）

　　总课题组成员：柯清超博士生（华南师范大学教育技术研究所）

　　陈品德副教授、博士生（华南师范大学网络中心）

　　邓文新讲师（华南师范大学教育技术研究所）

　　余 红副教授（华南师范大学教育技术研究所）

　　总课题组秘书：王冬青博士生（华南师范大学教育技术研究所）

　　高瑞利硕士生（华南师范大学教育技术研究所）

　　刘铁英硕士生（华南师范大学教育技术研究所）

　　孔维宏硕士生（华南师范大学教育技术研究所）

　　徐光涛硕士生（华南师范大学教育技术研究所）

　　杨淑莲硕士生（华南师范大学教育技术研究所）

　　尹 睿硕士生（华南师范大学教育技术研究所）

药学毕业论文开题报告(2)

　　药学毕业论文开题报告篇3
　　题 目 名 称： 番泻叶对小鼠尿量的影响

　　研究现状：

　　一、普鲁兰酶

　　普鲁兰酶(Pullulanase，EC.3. 2. 1. 41)是一种能够专一性切开支链淀粉分支点中的α-1.6糖苷键，从而剪下整个侧枝，形成直链淀粉的脱支酶。普鲁兰酶还可以分解普鲁兰多糖，普鲁兰酶来源于微生物，R-酶则来源于植物。普鲁兰酶最初是由Bender和Wallenfels于1961年通过产气气杆菌Aerobacter. aerogenes}(典型菌为肺炎克雷伯氏杆niae)发酵获得，他们报道了该酶良好的酶学性能。之后，各国的科研人员经过广泛深入研究，从不同的地区、微生物中获得该酶，掀起了开发普鲁兰酶的高潮。

　　在淀粉加工工业中，α淀粉酶最为常用，它的功能是水解淀粉的α-1,4糖苷键，单独用它时，产物中含有大量分支结构的糊精，其中就含有大量的α-1,6糖苷键。假如不把淀粉的α-1,6糖苷键彻底分解的话，势必会造成很大的浪费。自然界中，存在有能分解淀粉的α-1,6糖苷键的酶，通称为解支酶。如寡α-1,6葡萄糖苷酶( E.C3.2.1.68, Oligo-l,6-glucosidase )，普鲁兰酶(E.C3.2.1.41Pullulanase )，异淀粉酶( E.C3.2.1.68, Isoamylose )，支链淀粉一6-葡聚糖酶( E.C3.2.1.69,Amylopectin-6-gluanohydrase )，其中普鲁兰酶要求的底物分子结构最小，故而可以将最小单位的支链分解，导致可以最大限度的利用淀粉，所以在淀粉加工工业中有着重要的用途和良好的市场前景。故而许多国家都争相开发，但是到现在为止，只有丹麦的NOVO公司具有普鲁兰酶的生产能力。我国只有向其进口，但是其价格昂贵，限制了普鲁兰酶在我国的应用。其实，我国早在七十年代就开发普鲁兰酶的产生菌，但是该菌的酶学性质不适合生产，至今我国在普鲁兰酶的国产化方面还没有报道。

　　在淀粉的加工行业上，对普鲁兰酶的酶学性质的要求是耐酸耐热，其原因是因为通常使用外加酶化法，由于所用酶类的限制，普鲁兰酶的添加可以在两步反应的任何一步，但必须满足上述的反应的条件。因此所开发的普鲁兰酶的酶学性质必须满足现有的酶法水解制糖的条件，也就是耐酸耐热。

　　二、普鲁兰酶的研究现状

　　1.产普鲁兰酶的微生物

　　普鲁兰酶最初是由Bender和Wallenfels于1961年通过产气杆菌(Aerobacter

　　aerogenes)发酵获得。他们报道了该酶的良好性能之后，各国的科研人员经过广泛深入的研究，从不同的地区的微生物中获得该酶，掀起了开发普鲁兰酶的高潮。但是迄今为止，尽管发现许多微生物能够产普鲁兰酶，但是由于当今工业生产条件(酸性，温度)，大多数微生物所产的普鲁兰酶并无商业价值。以下便介绍一下普鲁兰酶的生产菌种。

　　1.1蜡状芽抱杆菌覃状变种(Bacillus cereus s)

　　由日本的ToshiyukiTakasaki于1975年发现。该菌同时产生两种淀粉酶:β-淀粉酶和普鲁兰酶。最佳作用条件为pH6～6.5，温度50℃，最大转化率(淀粉水解产生麦芽糖)大约为95%.酶学研究中发现，此酶在pH5，温度60℃依然保持大部分活性，该菌的营养细胞呈棒杆状，聚集成长短不等紊乱链状，无运动性，格兰氏阳性，产芽抱时细胞无明显膨胀。该菌最适生长温度30℃～37℃ ,最高生长温度在41℃～45℃，可以利用葡萄糖，甘露糖，麦芽糖，海藻糖，淀粉和糖原。

　　1.2嗜酸性分解普鲁兰多糖芽抱杆菌(ullulyticus)

　　上世纪八十年代初，丹麦Novo公司获得此菌，此菌所生产的普鲁兰酶耐热

　　(60℃)，耐酸(pH4.5)。该公司经过投入巨资开发研究，1983年Nov。公司在日本和欧洲市场同时商业化销售，商品名Prornozyme。如今，它是应用最广，产量最大的普鲁兰酶。ullrrlyticus呈棒状，深层发酵几小时后，可观察到类原生质体的膨胀细胞，较稳定，饱子呈圆柱体或椭圆体。格兰氏反应阳性，37℃生长良好，45℃以上和pI-1高于6.5以上不长，在以普鲁兰糖为碳源的培养基((pH4.8 ～5.2)上生长良好。

　　1.3枯草芽饱杆菌(Bacillus subtilis)

　　1986年，日本的Yushiyuki Takasaki报道了一株能产生耐热耐酸普鲁兰酶的菌种，被命名为Bacillus subtilis TU。此菌种所产生的酶为普鲁兰酶和淀粉酶的混合物，可水解淀粉为麦芽三糖和麦芽搪.水解普鲁兰糖为麦芽三糖，其中普鲁兰酶最佳作用pH为7.0～7.5，但在pH5.0时亦有约50%的酶活，此普鲁兰酶最佳作用温度60℃。

　　1.4耐热产硫梭菌(Clostridum Themosulfurogenes)

　　1987年.德国的等报道了一株能同时产a淀粉酶、普鲁兰酶和葡萄糖淀粉酶的菌种:耐热产硫梭菌。该菌种所产普鲁兰酶有较广的温度适应范围(40℃～85℃)，在pH4.5～6.0有较高的活性，在如此广的范围内都有较强活力无疑将扩大该普鲁兰酶的应用领域.

　　1.5 Bacillusnaganoensis,Bacillus deramificans,ullulyticus

　　上世纪九十年代，Deweer发现了普鲁兰酶产生菌Bacillus naganoensis;Tomimura筛选出Bacillus deramifrcans。这两株菌所产的普鲁兰酶的酶学性质与Bacillus. Acidopullulyticus的酶学性质相似。这两株菌都是中度嗜酸菌，在pH6.5以上就不生长，温度超过45℃以上同样也不生长。这两株普鲁兰酶产生菌的发现，进一步拓宽了普鲁兰酶的应用。

　　1.6产普鲁兰酶的高温菌菌种

　　自上世纪八十年代以来，人们逐渐意识到在通常的自然条件下，很难筛选得到极端耐热的普鲁兰酶生产菌种，于是各国的科学家便把目光转移到温泉嗜高温细菌的筛选，而且现在已经取得较多的成果。Bacillus如vorcaldarius所产普鲁兰酶的最适温度和pH分别是75～85℃, pH6.3, Thermotoga maritime的最适温度和pH分别是90℃, pH6.0, Thermurs caldopHilus的最适温度和pH分别是75℃,pH5.5, Fenidobacterion pernnavoran最适温度和pH分别是80～85℃, pH6.0o

　　2.普鲁兰酶的分子结构

　　至今为止，许多普鲁兰酶的基因己经被克隆，但是还没有见到任何有关普鲁兰酶结构的报道，但是在根据序列相似性对糖普键水解酶的分类，普鲁兰酶属于第13家族，α淀粉酶家族，这个家族中包含了30多种酶，可以分为水解酶，转移酶。异构酶三大类。这些酶能够水解和合成α～1.4,α～1.6,α～1.2,α～1.3,α～1.5,α～1.1糖苷键。其中很多酶的结构已经被报道，它们都采取了(β/α)8的结构，通过生物信息学的研究，这个家族的蛋白都有一个共同的结构，酶的活性中心都是(β/α)8折叠筒的结构，命名为结构域A。第13家族的大多数酶还具有结构域B，它是位于(β/α)8折叠筒中，第三个β片层与第三个α螺旋之间的一段序列，其特点是结构和长度差异较大，推测其功能是与底物的结合有关。在紧接着(β/α)8折叠筒后，还有C结构域，紧接C结构域，部分家族成员还有结构域D。

　　3.普鲁兰酶的应用

　　普鲁兰酶，在食品工业中是一种用途广泛的酶制剂和加工助剂。它能专一性分解淀粉中的支链淀粉和糖原分子及其衍生的低聚糖分支中的α～l, 6糖苷键，使分支结构断裂，形成长短不一的直链淀粉。因此，将该酶与 其它 淀粉酶配合使用时，可使淀粉糖化完全。近年来，普鲁兰酶己作为淀粉酶类中的一个新酶种，应用于淀粉为原料的食品等工业部门，在食品工业中有如下几方面的作用:

　　3.1单独使用普鲁兰酶，使支链淀粉变为直链淀粉

　　直链淀粉具有凝结成块，易形成结构稳定的凝胶的特性，因此，可作为强韧的食品包装薄膜。这种薄膜对氧和油脂有良好的隔绝性，又因涂布开展性好，故适合于作为食品的保护层。它还适合于淀粉软糖制造，也可用作果酱增稠剂，用于装油脂含量高的食品，以防止油的渗出以及肉食品加工。近年来在食品工业中提倡使用可被生物降解的薄膜，直链淀粉在这些方面具有较大的发展前途。豆类直链淀粉含量较高，因此绿豆淀粉制成的粉丝韧性比其它淀粉好，如果用普鲁兰酶处理谷物淀粉，再制成直链淀粉后，可以制成高质量的粉丝。一般谷物淀粉中，直链淀粉含量仅占20%，支链淀粉含量约为80%。工业上每生产1吨直链淀粉就有4吨副产品的支链淀粉。美国虽然通过遗传育种的方法.得到含直链淀粉60%玉米新品种，但不大适于大量生产。国外已采用普鲁兰酶改变淀粉结构，可使支链淀粉变为直链淀粉。据报道，采用此法收率可达100%.制造直链淀粉的方法为，先采用普鲁兰酶分解经液化的分支部分，使其转变为直链淀粉，并以丁醇或缓慢冷却法沉淀淀粉。再回收含少量水分的晶型沉淀物，最后通过低温喷雾干燥法制成粉状的直链淀粉。

　　3.2普鲁兰酶与β～淀粉酶配合使用生产麦芽搪

　　饴糖是我国传统的淀粉糖产品，其中所含部分麦芽糖，广泛用于糖果、糕点等食品工业。目前生产方法是以α～淀粉酶进行液化，再用β～淀粉酶水解支链淀粉，这样只能水解侧链部分。接近交叉地位的α～1.6糖苷键时，水解反应停止。但如果使用普鲁兰酶共同水解，便能使分支断裂，提高淀粉酶水解程度，降低了β极限糊精的含量，大大提高了麦芽糖的产率，有利于生产麦芽搪浆。目前对加普鲁兰酶进行糖化己作了较大规模的试验。

　　试验条件为。每批投料量约为900公斤碎米，粉浆浓度为15～16Be°数皮用量1.5%(对碎米计)，β～淀粉酶活性2,000单位/克以上，pH5.8;普鲁兰酶活性45,000～55,0 00单位/克，系由产气气杆菌生产，每批用量为1公斤。试验结果表明，加入普鲁兰酶糖化的试验糖与对照糖品相比，还原糖平均增加14.8，麦芽糖含量平均增加了45.6，糊精含量平均减少了26.7高浓度麦芽糖浆较之高浓度葡萄搪浆，具有不易结晶，吸湿性小的特点，所以高浓度麦芽糖浆在食品工业中有着广泛的用途。采用普鲁兰酶与p一淀粉酶配合使用，成本低廉，麦芽糖收率达到70%左右，其至更高。

　　3.3用于啤酒外加酶法糖化

　　啤酒生产中麦芽，既是酿造啤酒的主要原料，也为酿造过程提供了丰富的酶源。在啤酒酿造的糖化过程中，麦芽中分解淀粉的主要酶是α～淀粉酶、β～淀粉酶和分解淀粉α～1. 6糖瞥键的R一酶(植物普鲁兰酶或植物茁霉多糖酶)。β～淀粉酶与另两种淀粉酶协同作用，可使淀粉分解成麦芽糖(也包括少量的麦芽三糖和极少量的葡萄糖)和低分子糊精。使麦芽汁有比较理想的糖类组成。在工业生产中为了节约麦芽用量，采用所谓外加酶法糖化，即在减少麦芽用量的前提下，增加淀粉质辅助原料的比率，并加入适当种类的酶制剂进行搪化。要使大麦及其它辅助原料糖化完全，需要外加a一淀粉酶和分解α～1.6糖苷键的普鲁兰酶制剂等。单独使用a一淀粉酶时产生麦芽糖和麦芽三搪是很不完全的。假如分解淀粉α～1.6糖苷键的酶活性不足，淀粉分解就不完全，其结果是可发酵性糖含量低，制成的啤酒发酵度达不到要求。若采用能分解α～1.4和α～1.6糖苷键的糖化型淀粉酶，则其反应产物为葡萄糖，容易使酒味淡薄。采用普鲁兰酶与α～淀粉酶协同，效果良好，其分解产物主要是麦芽糖和少量的麦芽多糖。采用外加酶法糖化时，加入酶制剂的用量为:淀粉酶6～7单位/克大麦及大米:蛋白酶，60-80单位/克，并配合以菠萝蛋白酶10ppm，普鲁兰酶50单位/克大麦。以上三种酶制剂均添加于糖化或酒化开始。

　　总之，普鲁兰酶无论作为酶制剂和食品工业的加工助剂均有广阔的发展前途。

　　研究目的和意义：

　　酶制剂工业是上世纪七十年代就己经形成的一个重要的产业，目前世界酶制剂总产值达100亿美元，我国的产值约为100亿人民币，并且随着其应用领域的不断扩大以及新酶种的开发，这一市场正在迅猛发展。但是全球酶制剂产业几乎被几家外国公司所垄断，其中丹麦的NOVO公司几乎占全球总销售额的一半。本研究对普鲁兰酶的开发，对酶制剂产业的发展有重要的意义。

　　其次我国自从七十年代开始便对普鲁兰酶进行研究开发，但是所开发得到的普鲁兰酶，既不耐热也不耐酸，这就使其在工业化应用中受到了局限。为了改变我国对进口产品的依赖，填补我国这一领域的空白，寻找一条国产化的道路，本研究的目的是利用自然微生物资源，普鲁兰酶，提高我国淀粉原料的利用率，从而提高整个淀粉加工行业的生产率，这对我国淀粉加工产业的意义是不言而喻的。

　　研究内容(内容、结构框架以及重点、难点)：

　　一.普鲁兰酶产生菌的筛选

　　(1)样品的采集;

　　(2)菌种初筛;

　　(3)菌种复筛;

　　(4)菌种保藏方法;

　　(5)酶活力测定方法的建立。

　　二.产普鲁兰酶菌株的产酶条件的研究

　　(1)碳源，氮源对发酵产酶的影响;

　　(2)初始PH对发酵产酶的影响;

　　(3)接种量对发酵产酶的影响;

　　(4)发酵温度对产酶的影响;

　　(5)金属离子对产酶的影响。

　　重点或关键技术：

　　(1)纯菌株的分离;

　　(2)菌株的鉴定方法的选择。

　　研究方法、手段：

　　一.普鲁兰酶产生菌的筛选

　　(1)样品的采集：选择适合产生的地点(面粉厂.菜地.果园等)采集土样

　　(2)菌种初筛：在采集的土样用无菌水稀释后，在含有淀粉类的培养基中做平板涂步， 37℃培养48h后，用碘液进行显色反应，将有淀粉酶产生的菌落接于斜面中保存。

　　(3)菌种复筛：将前期分离的能产生淀粉酶的菌株涂步于普鲁兰糖平板上，37℃培养48h后用95%乙醇进行透明圈实验。有透明圈产生说明菌株产生普鲁兰酶，将产生透明圈的菌落挑于斜面培养基培养。

　　(4)菌种保藏方法： 采用4℃低温保藏。

　　(5)酶活力测定方法的建立：采用发酵培养液经过离心后利用DNS显色法 520nm测定吸光值，测定标准葡萄糖标准曲线，利用标准曲线计算普鲁兰酶酶活大小。

　　二.产普鲁兰酶菌株的产酶条件的研究

　　(1)碳源，氮源对发酵产酶的影响：采用不同碳源，氮源培养基培养一段时间，测定酶活力。(其他条件相同：接种量，装瓶量，初始PH值，转速，培养时间。)

　　(2)初始PH对发酵产酶的影响：采用相同发酵培养基，在不同初始PH下接种等量种子液。在相同条件下培养，测定发酵液的酶活。(其他条件相同：接种量，装瓶量，转速，最佳培养温度，最佳培养时间。)

　　(3)接种量对发酵产酶的影响：在发酵培养基中分别接入2%，4%，6%，8%，

　　10%，14%，18%的种子培养液于最佳碳源，氮源，最佳初始PH的培养基中，在相同条件下培养，分别检测酶活。(采用以上确定的最佳碳源，氮源，最佳初始PH。)

　　(4)发酵温度对产酶的影响：采用相同培养基，在不同温度下(25℃，30℃，35℃，40℃，45℃)培养一定时间，测定酶活力。

　　(5)金属离子对产酶的影响：在基础培养基中加入少量不同金属离子，发酵后测酶活。(金属离子有： 锰离子，钙离子，锌离子，镁离子，铁离子，铜离子。)

　　研究进度

　　：完成项目总体进度30%，样品土样的采集及前期的准备工作,菌株的初筛，包括(样品土样原液的涂步培养及摇床培养，产支链淀粉酶菌株的挑选及斜面培养)。

　　：完成项目总体进度50%,菌株的复筛，包括(产普鲁兰酶菌株的筛选及斜面培养),葡萄糖标准曲线的测定,酶活测定方法的建立,并以酶活大小对菌株进行再次筛选。

　　：完成项目总体进度80%,产酶条件的研究。包括：碳源，氮源，初始PH值，接种量，发酵温度，金属离子。并通过各中单因素试验确定发酵培养基的最佳碳源，氮源，初始PH值，接种量，发酵温度，金属离子。

　　2009、4—2009、5 ：完成项目总体进度100%,课题总结，撰写论文。

　　文献综述(包括：国内外研究理论、研究方法、进展情况、存在问题、参考依据等)

　　自从1961年Bender H.等人在研究一株产气气杆菌Aerobacter aerogenes(典型菌为肺炎克雷伯氏杆菌niae)时首次发现普鲁兰酶后，国际上对产生这种酶的微生物进行了广泛研究，发现许多微生物可以产生此酶，并筛选出一些适用于工业化生产的优良菌株。随着该酶的应用发展，对耐热性普鲁兰酶的研究也逐渐增多，已成功克隆并表达了该酶的基因。国内1976年开始对一株产气气杆菌(Aerobacteraerogenes 10016)的普鲁兰酶进行研究，对该菌株的产酶条件、酶的分离提取及酶学性质作了报道，并研究了该酶的食品级提取技术。此外，陈朝银、刘涛等人从云南温泉水样中筛选到一株产普鲁兰酶高温栖热菌菌株，通过诱导等实验将该酶的酶活从0.069u/mL提高到170u/mL，酶产量提高了近2500倍左右，酶的最适作用温度及pH分别是75℃和4.5，具有一定的耐热和耐酸特性。

　　陈金全等从温泉水样中筛选到一株产耐热耐酸普鲁兰酶的野生菌株，并根据形态、生理生化特征、细胞化学组分分析及16SrDNA序列比对、基因组DNA的G+C摩尔百分含量、同源性比对等实验，鉴定其为脂环酸芽抱杆菌属(Alicyclobacillus)的一个新种，所产酶最适作用温度为60℃，最适pH值4.0，具有较好的耐热耐酸特性。杨云娟等利用毕赤酵母成功构建了普鲁兰酶表达量较高的基因工程菌，摇瓶发酵酶活可达350.8U/mL，最佳发酵条件下产量可达504.5-510.1U/mL .酶的最适作用温度为600C，最适pH值4.5，具有较好的耐热耐酸性。目前我国仍没有具备独立生产普鲁兰酶能力的厂商，要实现低成本、国产化的生产，还有很长的路要走。

　　技术应用于耐热脱支酶的研究，使耐热异淀粉酶的研究有了很大发展。Coleman等人将嗜热厌氧菌T. brockii普鲁兰酶基因克隆到is中得到的克隆子分泌的普鲁兰酶数量高于出发菌株，Okada等人将Bacillus Steanther, onhiu:中编码热稳定异淀粉酶的基因克隆到u:中，得到的转化菌株其异淀粉酶能在60 ℃稳定15分钟。Burchadf将。ostridium thermosulf urogenes DSM38%的嗜热异淀粉酶基因克隆并在中表达，所得酶的最适pH和最适温度与出发菌相同，而且在高温下仍能保持活性.Antranikiam等人将Pyrococcus舟riousous的异淀粉酶基因克隆到中并分离得到了酶蛋白。尽管如此，目前尚未有已将转基因的耐热性异淀粉酶工程菌应用到工业生产中的报道。众所周知，利用物理和化学诱变剂单独或复合处理微生物细胞是选育高产变种菌株行之有效的经典方法，它在为培育多种抗生素、氨基酸、核苷酸激酶(尤其是蛋白酶和淀粉酶)的高产变种菌株方面曾经起过极为重要的作用，至今仍然是方便易行和行之有效的方法之一。

　　主要参考文献：

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