β-胡萝卜素发酵培养基的优化全文

β-胡萝卜素发酵培养基的优化

学生姓名：刘 娇                    指导教师：戴德慧
（浙江科技学院生物与化学工程学院）

摘 要：通过对三孢布拉氏霉(Blakeslea trispora)发酵生产β-胡萝卜素的研究，从而进一步的探讨该情况下产生β-胡萝卜素的最优发酵培养基。本论文实验主要从发酵培养基内容的确定以及发酵条件的优化方面来考察。首先研究了培养基成分对三孢布拉氏霉发酵产β-胡萝卜素的影响，初步确定了以玉米淀粉作为碳源，黄豆粉作为氮源的发酵培养基配方。其次，通过不断地改变各种变量因子，来最终确定培养基各个成分的配比情况，如氮源浓度为3%，碳源浓度为3%，培养基pH值为7.0，植物油为35ml/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 1g/L，维生素B1 0.03g/L的情况。

关键词：三孢布拉氏霉菌；β- 胡萝卜素；发酵

The best fermentation medium of β- carotene

Student’s name:Liujiao        Advisor: Dai dehui
（School of Biological and Chemical Engineering， Zhejiang University of Science and Technology）

Abstract：Through the research about the fermentative conditions of β-carotene by Blakeslea trispora,with a view to further disquisition about the circumstances of the optimal β-carotene fermentation medium. This thesis mainly from the content of the fermentation medium and the fermentation ,study the infection about the component of the medium, and know the medium composition on Blakeslea trispora effect of β-carotene. Initially indentified as a carbon source to corn starch, soybean power as a source of fermentation medium. Secondly, through change the constant variables factor to determine the final composition of the ratio of the various media, such as nitrogen concentration of 3%,carbon concentration 3%,medium pH value of 7.0,vegetable oil to 35ml/L, , KH2PO4 2g / L, MgSO4 1g / L, vitamin B1 0.03g / L situation.

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Keywords：Blakeslea trispora； β-carotene ； Fermentation

目  录
中文摘要 I
英文摘要 II
目录 III
1. 绪论 1
1.1 β-胡萝卜素的来源及生理活性 1
1.1.1 类胡萝卜素的分类 1
1.1.2 β-胡萝卜素的来源 1
1.1.3 β-胡萝卜素的理化性质 2
1.2 β-胡萝卜素的生产方法 3
    1.2.1 化学合成 3
1.2.2 天然产物提取法 4
1.2.3 由盐藻培养 5
1.2.4 生物发酵法 5
1.3 β- 胡萝卜素的用途 5
        1.3.1 医药用途  6
1.3.1.1 抗氧化作用 6
1.3.1.2 抗癌作用 6
1.3.1.3 防治心血管疾病 7
1.3.1.4 在人体的吸收特性 7
1.3.2 食品用途  7
1.3.3 化妆品用途 8
1.3.4 饲料添加剂用途 8
1.4 β-胡萝卜素的稳定性 8
1.5 三孢布拉氏霉菌介绍和诱变选育 8
1.5.1三孢布拉氏霉菌介绍 8
1.5.2三孢布拉氏霉菌诱变选育 9
2. 实验部分.........................................................10
2.1 实验材料 10
2.1.1 主要培养基及其制备方法培养基 10
2.1.2.1 斜面培养基（PDA） 10
2.1.2.2 麦芽汁培养基 10
2.1.2.3 种子培养基 10
2.1.2.4 发酵培养基 10
2.2 主要试剂和仪器 10
2.2.1 主要试剂 10
2.2.2 主要仪器 11
2.2.2 试剂的调配 11
2.3 实验方法 11
2.3.1 β-胡萝卜素标准曲线的绘制 11
2.3.2 番茄红素标准曲线的绘制 11
2.3.3 菌种的活化 12
2.3.4 种子培养基的配置 12
2.3.5 不同变量的发酵培养基的配置 12
2.3.5.1 碳源为变量的发酵培养基的配置 12
2.2.5.2 氮源为变量的发酵培养基的配置 13
2.3.5.3 pH为变量的发酵培养基的配置 13
2.3.5.4 添加表面活性剂来测定对产量的影响 13
3. 结果与讨论 14
3.1 标注曲线的绘制 14
3.1.1 β-胡萝卜素标准曲线绘制 14
3.1.2 番茄红素标准曲线绘制 15
3.2 碳源为变量的发酵培养基对β-胡萝卜素产量的影响 15
3.3 氮源为变量的发酵培养基对β-胡萝卜素产量的影响 18
3.4 pH为变量的发酵培养基对β-胡萝卜素产量的影响 21
3.5 添加表面活性剂来测定对产量的影响 24
4．总结与展望 27
致谢 28
参考文献 29
1 绪论　
β- 胡萝卜素(β- carotene) 的稀溶液呈鲜艳的橙黄色,是一种优良的色素,在人体和动物体内可以转化为维生素A ,同时还有较强的抗氧化功能,因此兼具有较高的营养价值和药用价值。目前广泛应用于食品、药品、化妆品、和保健品行业[1]。天然β-胡萝卜素可以从富含β- 胡萝卜素的植物和藻类中提取,但是这种方法受产地、自然条件等限制，产量有限。三孢布拉霉( Blakeslea trispora) 在培养过程中不需要光照,生物量大,能大量产生β- 胡萝卜素,目前在俄罗斯、乌克兰等国已实现了工业化生产[2]。但是三孢布拉霉发酵工艺复杂,不稳定,产量低是目前存在的主要问题。本文在优化菌种的基础上，以定量孢子接种的种子培养方式,同时优化接种量、正负菌的最适接种比例,提出了在种子培养阶段,正负菌孢子混合培养。比较了各种氮源、碳源、pH、以及表面活性剂对发酵产量的影响。
1.1β-胡萝卜素的来源及生理活性
1.1.1 类胡萝卜素的分类
类胡萝卜素可分为4 个亚族：胡萝卜素如α- 胡萝卜素、β- 胡萝卜素、γ- 胡萝卜素、番茄红素；胡萝卜素醇如叶黄素、玉米黄质、虾青素；胡萝卜素醇的酯类如β- 阿朴- 8’- 胡萝卜酸酯；胡萝卜酸如藏红素、胭脂树橙。
1.1.2 β-胡萝卜素的来源
在自然界中，β-胡萝卜素最丰富的来源是绿叶蔬菜和黄色的，橘色的水果 （如胡萝卜、菠菜、生菜、马铃薯、番薯、西兰花、哈密瓜和冬瓜)。大体上,颜色越是强烈的水果或蔬菜，越是富含更多的β-胡萝卜素。在动物和人体内，β-胡萝卜素主要存在于肝脏、脂肪、甲状腺、肾、脾脏、胰脏、软巢、肾上腺等组织中［3］。
1.1.3 β-胡萝卜素的理化性质
全反式β-胡萝卜素的化学名为全反式-1,1'-((3,7,12,16-四甲基-1,3,5,7,9,11,13,15,17-十八碳九烯-1,18-二基)双[2,6,6-三甲基环已烯]。相应的英文化学名1,1(3,7,12,16-teteamethyl-1,3,5,7,9,11,13,15,17-octadecanonaene-1,18-diyl）bis[ 2,6,6-trimethyl-,(all-E)-[4]。是一种棕红色有光泽的斜方六面结晶，不溶于水，易溶于二硫化碳、氯仿、己烷、植物油等有机溶剂。分子式为C40H56，其化学结构为两边反向对称，分子结构中包含有两个β-紫罗兰酮和四个异戊二烯CH2=C(CH3)-CH=CH2。当β-胡萝卜素双键处断裂后可分解为两分子的维生素A，因而在人体摄入后可作为维生素A源，补充人体的维生素A。它普遍存在于动物、植物、真菌、藻类和细菌中，呈黄色、橙红色或红色。图1是全反式β-胡萝卜素的分子式。
 
图1 全反式β-胡萝卜素的分子式
当然，β-胡萝卜素有各种顺反不同异构体，例如：
全反式-β-胡萝卜素（all-trans-β-carotene）；
9-顺式-β-胡萝卜素（9-cis-β-carotene）；
13-顺式-β-胡萝卜素（13-cis-β-carotene）；
β-胡萝卜素是共轭双键化合物，在紫外光谱中有3个吸收峰（455nm，483nm，40nm）。在分析测定中用A455/A340，A455/A483的比例来控制β-胡萝卜素的顺式异构体及类胡萝卜素。它在十八种溶剂中的溶解度及吸光性见表1[5］。
由于众多不饱和双键的存在，β- 胡萝卜素对各种化学作用都很敏感。易于和氧、臭氧以及各种化学氧化剂如过氧化物、铬酸、高锰酸钾作用发生不同程度的氧化，转变成环氧化物、吠喃环氧化物、醛、酮、缩酮，轻基胡萝卜素等。β- 胡萝卜素的氧化开始于最不稳定的核上双键，再逐渐扩展到空间障碍最大的不饱和键。光、热、酸的存在能大大加快β- 胡萝卜素的氧化。一些抗氧化剂如常见的BHT和维生素E等能在不同程度上降低β- 胡萝卜素的氧化速度。β- 胡萝卜素分子上的不饱和双键还可发生加成反应。氢碘酸还原β- 胡萝卜素形成相应的5, 6一二氢一β- 胡萝卜素；反应发生在最不稳定的核上不饱和键上。当催化加氢时，氢逐渐加到全部双键，形成部份还原产物的混合物或最终的无色多氢胡萝卜素。当以N-溴丁二酞亚胺溴化β- 胡萝卜素时，溴进入核上，而涉及双键；但元素溴则添加到整个多烯重键上。β- 胡萝卜素在真空或隋性气体中，加热、光照下β- 胡萝卜素不发生化学反应，但能引起异构化，最终达到各种异构体的平衡，碘能加快此过程[6]。
表1 β- 胡萝卜素在不同溶剂中的特性
溶剂 溶解度  吸收峰 吸光度 摩尔吸光度
 mg/l λmax（nm） E-1•CM-1 L•mol-1•cm-1
丙酮 200 452 2559 137400
乙腈 10 452 2540 136400
苯 4000 462 2304 124000
氯仿 2000 462 2330 125100
环己烷 2000 454 2508 134700
环己酮 2000 462 2359 126700
二氯甲烷 6000 460 2369 127200
DMF 200 460 2389 128300
DMSO 30 466 2259 121300
乙醇 30 450 2529 135800
乙腈 500 452 2520 135300
乙醚 1000 448 2659 142800
己烷 600 448 2592 139200
2-丙醇 40 450 2508 134700
甲醇 10 450 2540 136400
MTBE 1000 450 2588 139000
THF 10000 456 2399 128800
甲苯 4000 462 2270 121900
1.2 β-胡萝卜素的生产方法
1831年Wackenroder首次从胡萝卜中提取出来β-胡萝卜素。在1954年，罗氏精细化学品公司率先化学合成β-胡萝卜素，并由Isler等人于1956年首先完成了工业化合成生产。
β-胡萝卜素的生产方法主要有提取法、生物发酵法、盐藻培养和化学合成法。提取法受原料含量低、纯度低的限制而产量很小。化学合成法技术复杂，而且由于人们对化学合成品的警惕性的提高，其产品售价远不如天然品的高[7］。
1.2.1化学合成
化学合成法是指采用有机化工原料，通过化学合成反应，人工合成β-胡萝卜素的一种方法。
根据近年来的研究报道，在合成品中的β-胡萝卜素全为全反式构型，而天然β-胡萝卜素除有全反式构型外，还含有不同程度的9-顺式和15-顺式构型，其中9-顺式β-胡萝卜素在胡萝卜的遗传毒性和抗遗传毒性中起着关键作用。
(1)以紫罗兰酮为原料，经链增长反应获得碳19醛，后者由两分子缩合经格氏反应生成碳40醇再经部分氢化、脱水和分子重排生成胡萝卜素。
(2)由三分子的乙酰辅酰菌经缩合、磷酸化、脱羧，再经多步缩合成八氢番茄红素，逐步脱氢成胡萝L素，其反应工序较长。
(3)利用生产VA乙酸酯中的副产母液，经其浓缩水解成VA，再将其中部分氧化，在氮气保护下制成VA醛。将另一部分制成VA磷盐，两者在甲醇钠催化剂存在下，在氮气保护下制成13-顺式-胡萝卜素，再继续进行异构化反应制成胡萝卜素。
由于采用化学方法合成的β-胡萝卜素由于不能完全被人体吸收，且技术复杂、难度大、活性低，并对人体产生一定程度的毒副作用，长期服用还会对人体产生不可逆转的病变，因而不被大多数食品学家所接受，在西方发达国家已被禁止用作食品添加剂等方面，天然提取的β-胡萝卜素易于被人体吸收，并具有较好的抗氧化能力，从而形成较高的需求热潮。
1.2.2 天然产物提取法
目前，天然β-胡萝卜素的需求增长大于化学合成品，国际市场上天然品的售价约为化学合成品的3倍。因而有相对多得研究着眼于采用化学方法从天然植物、藻类等原料中提取β-胡萝卜素。
工业生产中常用胡萝卜、棕榈等作原料。其主要工艺路线如图2所示：
 图2  从天然植物中提取胡萝卜素
由于天然植物等所含β-胡萝卜素量很少，不但增加了原料成本，要得高纯度产品，更增加了纯化难度。从植物中提取天然β-胡萝卜素，受原料含量、气候、产地和运输等条件限制，且工艺复杂，难以大量生产，产品着色力差，因而其大规模生产前景并不十分看好，在现有市场中所占份额也较小。
1.2.3由盐藻培养
盐藻中含有丰富的β-胡萝卜素，工业上采用盐生杜氏藻和巴氏杜氏藻uril培养生产β-胡萝卜素。杜氏藻培养生产β-胡萝卜素需要高光照、强辐射、高含盐量、缺N、P等低营养以及低溶氧条件下才能达到提高产量的目标，在大面积培养杜氏藻中要解决藻种退化的问题。据报道，高产藻株产类胡萝卜素L，生产中常用二步法培养，如以色列先在15%NaCl中使用高营养培养使杜氏藻大量生长，第二步罐入到25%NaCl低营养培养以有利于β-胡萝卜素的积累[8]。
1.2.4生物发酵法
生物发酵法又称为生物合成法，是指利用微生物培养技术，通过微生物的培养，利用微生物在其体内合成β-胡萝卜素，然后自微生物体内分 离得到β-胡萝卜素的一种方法。
发酵法生产β-胡萝卜素主要用菌株有布拉克须霉菌(PHycomyoces blakeskeanus)、三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispora)和红酵母(Rhodotorula)。三孢布拉氏霉菌和布拉克须霉合成β-胡萝卜素的能力都比较强。采用三孢布拉氏霉发酵生产天然胡萝卜素，其β-胡萝卜素合成水平极大高于多种生物体，β-胡萝卜素占总胡萝卜素90％以上，其结构与标准的β-胡萝卜素相同；并具有生产原料来源广泛，不受自然条件制约，周期短和宜于工业化生产等优点。
由于酵母发酵的β-胡萝卜素产量不高，普遍认为真菌中的三孢布拉氏霉是理想的生产类胡萝卜素的菌株，并且其在工业生产中被应用得最为广泛。
发酵法生产天然β-胡萝卜素，菌体中所含β-胡萝卜素量是胡萝卜中含量的100倍，主要原料一般是玉米淀粉价廉。国外资料报道，解决好发酵工艺、细胞破碎技术及高效提取纯化技术是能否工业化的技术前提，目前红酵母发酵水平远远低于霉菌，即总色素量及β-胡萝卜素的含量都比霉菌低得多，但具有成本较低、便于工业化生产、菌体可综合利用等优点[9]。
1.3 β-胡萝卜素的用途
自然界中已分离出600多种类胡萝卜素，其中能被人体吸收和利用的仅40余种。β-胡萝卜素广泛地存在于人们常见的食物中，是所有类胡萝卜素中含量最大、被研究最多的一种。近年来的研究表明，在众多的类胡萝卜素中，β-胡萝卜素的生物活性最大，它除了作为维生素A的前体，还被认为是一种有效的生物抗氧化剂，即清除体内自由基，淬灭单线态氧，增强细胞间交流，进而具有提高机体免疫能力，预防肿瘤、血栓、动脉粥样硬化以及抗衰老等功能。
1.3.1医药用途
1.3.1.1抗氧化作用
β-胡萝卜素具有高效泯灭单线态氧和清除自由基的作用，单线态氧是很强的自由基，能够与很多不能直接与氧发生作用的分子直接结合[10]。
单线态氧有物理和化学两种方式:
物理方式是通过把激发态氧的能量传递给β-胡萝卜素，产生基态的氧和激发态的三线态β-胡萝卜素，再通过三线态β-胡萝卜素和周围介质之间相互的分子振动和转动作用，使能量散发，同时产生基态β-胡萝卜素。
化学泯灭主要通过β-胡萝卜素与氧发生分解的方式来完成的。β-胡萝卜素的高活性的富含电子的长多烯碳链，使它具有抗过氧化自由基的作用。Burton指出:在强的氧化剂作用下，β-胡萝卜素与过氧化物自由基作用，产生碳原子为中心的共振稳定的自由基，然后再与过氧化物自由基作用生成非自由基化合物。
因此，β-胡萝卜素可保护人体免受单氧和自由基的作用而带来的伤害。Patrizial等人研究发现，β-胡萝卜素可以降低淋巴细胞的损伤。
1.3.1.2抗癌作用  
研究表明[11]β-胡萝卜素能够在细胞水平上抑制神经角质瘤细胞、白血病细胞的增殖作用，而且通过缝隙连接可诱导细胞间的信息传递，可抑制变性细胞的增殖。关于其抗癌机制的解释是:A.它具有泯灭单线态氧和自由基的作用，保护组织细胞免受氧化损伤；B.通过缝隙连接信息诱导，促进细胞正常连接。研究还表明[12]，β-胡萝卜素具有淬灭单线态氧和缝隙连接信息诱导的作用，而且，这两种抗癌机制可能是相互独立发生作用的。
1.3.1.3防治心血管疾病
美国华盛顿医院Henmokense (1992 )临床试验证实，长期服用β-胡萝卜素制品，有心绞痛冠状动脉硬化史的高危组病人再发病率显著降低，并建议用β-胡萝卜素防治心肌梗塞、中风等主要的心血管疾病。   
Louise (1992)研究认为[13]，β-胡萝卜素之所以能够提高人体的免疫功能，防止肿瘤和动脉粥样硬化，主要通过清除游离态氧而减少光敏氧化作用。另外，β-胡萝卜素能与过氧化基团起化学反应，产生环氧化物和阿扑胡萝卜素，从而起到保护机体的作用。
1.3.1.4在人体的吸收特性
β-胡萝卜素在动物和人体内均通过小肠粘膜摄取和吸收。自然界中的类胡萝卜素，主要以其蛋白质复合物即胡萝卜素蛋白的形式存在。胡萝卜素蛋白能抑制胡萝卜素的消化与吸收；适当加热能提高β-胡萝卜素的浸出率与生物利用率；加热过度则可引起胡萝卜素全反式双键的异构，从而降低或改变其生物活性，甚至活性完全丧失。在摄食β-胡萝卜素的人群中，β-胡萝卜素主要储藏在肝脏、脂肪、甲状腺、肾、脾脏、胰脏、卵巢、肾上腺等组织中[14]。
1.3.2 食品用途
β-胡萝卜素具有防止衰老和增强免疫力等作用，也是重要的色素，是联合国粮农组织（Food and Agricultrure Organization of the United Nations)，简称：FAO）和世界卫生组织（World Health Organization，简称：WHO）食品添加剂联合专家委员会认定的A类优秀有营养的食品添加剂。全世界已有52个国家、地区批准使用，国际上需求量在1000吨以上，年增长率达10～15％，可作为人造奶油、色拉油、芝麻油等脂类食物的强化剂，以帮助人体对β-胡萝卜素的吸收。
1.3.3 化妆品用途
β-胡萝卜素的提取物含丰富的氨基酸、维生素、天然保湿因子、微量元素和其它生物活性物质，在日用化妆品（唇膏、胭脂等）中添加β-胡萝卜素，色泽丰满自然，还能起到保护皮肤的作用。
1.3.4 饲料添加剂用途
胡萝卜素、虾青素等类胡萝卜素是天然色素，而且是人和动物体内重要的生物活性物质，具有增色和营养双重功效。作为饲料添加剂，能提高动物的生长速率和肉类质量，提高牛、马、猪的繁殖能力，增强蛙鱼、虾的色质，加深禽蛋的颜色。
1.4 β-胡萝卜素的稳定性
β-胡萝卜素是多共扼双键化合物，易受光、热、金属离子等的影响，这与其分子结构密切相关。吕爽[15]等人研究了光和热等物理因素，以及常用食品防腐剂苯甲酸钠和常用金属离子对β-胡萝卜素稳定性的影响。结果表明: β-胡萝卜素对光、热的稳定性较差；常见防腐剂苯甲酸钠对β-胡萝卜素的稳定性基本没有影响；一价金属离子Na+和K+对β-胡萝卜素稳定性的影响都不是很明显，Na+和K+浓度的变化对稳定性基本没有影响。二价离子Cu2+对β-胡萝卜素稳定性影响最为明显，其次是Fe2+，Mg2+和Ca2+对β-胡萝卜素稳定性影响最小。Cu2+随着浓度的增加对β-胡萝卜素稳定性影响增强，其他几种二价金属离子浓度的改变对&bet a;-胡萝卜素稳定性基本没有影响。A13+对β-胡萝卜素稳定性影响不大，但是，Fe3+对β-胡萝卜素稳定性影响明显。因此，在保存β-胡萝卜素时应低温避光保存，并且尽量避免使用铜制或铁制容器，同时常用食品防腐剂苯甲酸钠可以添加到β-胡萝卜素中，它对色素稳定性基本没有影响。
1.5三孢布拉氏霉菌介绍和诱变选育
1.5.1三孢布拉氏霉菌介绍
三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispora)隶属于毛霉目(Mucorales），笄霉科(ChoanepHoraceae)，布拉霉菌属(Blakeslea)[16]。三孢布拉氏霉菌是一种产β- 胡萝卜素的高产菌， 该菌具有独特的代谢过程， 番茄红素是其代谢途径中的一个中间产物， 通过添加阻断剂来抑制β- 胡萝卜素生物合成途径中番茄红素环化酶的活性， 从而积累番茄红素。
1.5.2三孢布拉氏霉菌诱变选育
三孢布拉氏霉菌主要以多核体的形式存在， 极易退化。因此， 选育遗传稳定性高的菌株是提高番茄红素产量的一个重要途径。实验表明通过采用紫外线照射、亚硝基胍和离子束综合诱变处理， 均可获得三孢布拉氏霉菌优良负株[17]。

2. 实验部分
2.1实验材料
2.1.1菌种
三孢布拉氏霉(Blakeslea trispora)正菌（＋），负菌（－）。
2.1.2 主要培养基及其制备方法培养基
2.1.2.1 斜面培养基（PDA）：
土豆浸20％，葡萄糖1%，蔗糖1％，酵母粉0.1％，琼脂2.5％，pH值自然。
2.1.2.2 麦芽汁培养基
麦芽汁：2%          葡萄糖：2%            琼脂：2%-1.5%
2.1.2.3 种子培养基
黄豆粉：5%          玉米粉：2.5%          维生素B1:0.005% 
2.1.2.4 发酵培养基
玉米淀粉：40g/L     黄豆粉：20g/L         植物油：35ml/L
磷酸二氢钾：2g/L    硫酸镁：1g/L          VB1:0.03g/L    
异烟肼：12ml/L      β-紫罗酮：15ml/L
2.2 主要试剂和仪器
2.2.1 主要试剂
植物油：市售
OP乳化剂：市售
β-紫罗酮：市售
Tween 80（BP）：市售
维生素B1（BR）：市售
Span 40、20（CP）：市售
异烟肼（CP）：药店购买
2.2.2 主要仪器
超净工作台    SW-CJ-1B单人单面净化工作台    苏州净化设备有限公司
pH酸度计      PHS-25型数显酸度计            中国雷磁分析仪器厂
蒸汽灭菌锅    01J2003-04型立式压力蒸汽灭菌器筒   上海东亚压力容器制造有限公司
蒸汽灭菌锅          YXQ-LS-50SII   上海博讯实业有限公司医疗设备厂
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万用电热器          嘉兴市欣欣仪器设备有限公司
Constant temperature breeding shaker   Double largen all temperature  
Cultuaring shaking table     Constant temperature  ZHCHENG
其他玻璃仪器：平皿，试管，锥形瓶，容量瓶，移液管，小漏斗和移液枪等
2.2.3 试剂的调配
10%的β-紫罗酮:5ml的100%的β-紫罗酮与45ml的酒精
0.05%的异烟肼:0.02g的异烟肼与40ml的蒸馏水
1‰的司班40:200mg的100%的司班溶于100ml的蒸馏水，取上述混合液25µl
0.05‰的司班40:200mg的100%的司班溶于100ml的蒸馏水，取上述混合液12.5µl
1‰的司班20:200mg的100%的司班溶于100ml的蒸馏水，取上述混合液25µl
0.05‰的司班20:200mg的100%的司班溶于100ml的蒸馏水，取上述混合液12.5µl
2.3实验方法
2.3.1 β-胡萝卜素标准曲线的绘制
配制标准溶液：称取β-胡萝卜素标准品0.010g，取2ml三氯甲烷溶解，再用石油醚定容于50ml的容量瓶中,得到200.00mg/L的标准液，再分别稀释成0.80mg/L，1.60mg/L，2.0mg/L，2.40mg/L，2.80mg/L，在450nm条件下测定吸光值。
2.3.2 番茄红素标准曲线的绘制
配制标准溶液：称取番茄红素标准品0.010g，取2ml三氯甲烷溶解，再用石油醚定容于50ml的容量瓶中,得到200.00mg/L的标准液，再分别稀释成0.80mg/L，1.20mg/L，1.60mg/L，2.0mg/L，2.40mg/L，2.80mg/L，在471nm条件下测定吸光值。
2.3.3 菌种的活化
称取麦芽汁培养基，配置成200ml的培养基。在电炉上加热至溶解，并用玻璃棒不断的搅拌。将上述培养基分装在三个干净的锥形瓶中，用纱布和报纸封口，包扎。洗干净12套平皿，用报纸包扎好。将锥形瓶和平皿都放置在121℃的灭菌锅中，灭菌20min。灭菌后，将他们放置在无菌操作台中，在无菌条件下，倒置平皿，每个大致为15ml。冷却。将保存的三孢布拉氏霉菌取出，在无菌操作台中，点燃酒精灯，用无菌的镊子取一块含有菌种的培养基放置在新的培养基中。其中应该注意在接种正菌时，将长有菌种的一面朝向培养基，而负菌则正好相反。
2.3.4 种子培养基的配置
在菌种活化48h后，以配成500ml 的培养基为基础，按照上述的比例称取种子培养基所需的样品，在电炉上加热至溶解，并用玻璃棒不断的搅拌。冷却。用50ml 的量筒量取50ml的种子培养基放置于洗干净的锥形瓶中，用报纸包扎好瓶口。将打孔器、镊子、1000µl的大小枪头用报纸包好。将上述的仪器和液体放置于121℃下的灭菌20min。灭菌后将其拿出放在超净台中冷却。在无菌的操作条件下，用打孔器将活化好的菌种打孔，用镊子夹取一片放置在含菌丝的培养基中，包扎好后放在28℃下200rmp的摇床培养基下培养。
2.3.5 不同变量的发酵培养基的配置
2.3.5.1 碳源为变量的发酵培养基的配置
按照上述所述的发酵培养基的比例，配置发酵培养基。其中，将玉米淀粉的含量按照2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%的比例依次配置。每个锥形瓶中放置50ml的发酵培养基，包好，灭菌。选取生长良好的正、负培养基两瓶，在无菌操作下将他们倒入无菌的烧瓶中，用菌种打碎机打碎。在无菌条件下，取50的种子培养液加入到每瓶发酵瓶中。包扎好放置与摇床中培养。在44h后，加入0.05%的异烟肼和10%的β-紫罗酮，继续摇床培养。在72h后，将摇床的锥形瓶取出，要八层纱布过滤，称取湿重，并根据其质量决定所需的5%的BHT的量。在50℃的烘箱中放置20h。取出后称取重量，并研磨成粉末，并称取0.01-0.05g的样品，边研磨边加石油醚至液体的为无色，定溶至25ml，并在450nm和471nm下测取吸光度。计算出最适合菌体生长的培养基。
2.3.5.2 氮源为变量的发酵培 养基的配置
按照碳源3%的比例配置发酵培养基，其中将氮源的浓度依次从1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%进行实验，其中每个不同的浓度做四个对照组。其余的实验步骤按照以碳源为变量的步骤进行。再测定吸光度后计算出最适合菌体生长的氮源的浓度。注意实验中的染菌的风险。
2.3.5.3 pH为变量的发酵培养基的配置
按照碳源3%、氮源3%的比例配置发酵培养基，并且调节发酵培养基的pH值，用pH调节仪将它们的pH依次调制至6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，其余的实验步骤按照以碳源为变量的步骤进行。再测定吸光度后计算出最适合菌体生长的pH的值。
2.3.5.4 添加表面活性剂来测定对产量的影响
以碳源3%、氮源3%、pH为7.0来配置发酵培养基，之后向其中添加不同浓度、不同产品的表面活性剂。配置司班20、司班40、OP乳化剂、吐温80的1‰、0.5‰浓度的培养基各四组以及两组对照组。然后将配置好的培养基放入灭菌锅中灭菌，之后按照以前的步骤进行培养和测定。计算出能够促进菌体产β-胡萝卜素的量以及表面活性剂。

3.结果与讨论
3.1 标准曲线的绘制
3.1.1 β-胡萝卜素标准曲线绘制
不同浓度β-胡萝卜素标准品450nm处的吸光值见表2，β-胡萝卜素标准品的标准曲线图见图3。
表2 不同浓度β-胡萝卜素标准品450nm处吸光值
浓度（mg/L） 吸光度
0.8 0.100
1.6 0.205
2.0 0.271
2.4 0.327
2.8 0.372
 
图3 β-胡萝卜素标准曲线
由表2、图3可知，标准曲线的线性回归方程为 y = 0.1389x-0.0118，R2
为0.9978，表明线性关系良好。
   3.1.2 番茄红素标准曲线绘制
不同浓度番茄红素标准品471nm吸光值见表3，番茄红素标准品的标准曲线图见图4。
表3 不同浓度番茄红素标准品471nm处吸光值
浓度（mg/L） 吸光度
0.8 0.234
1.2 0.366
1.6 0.494
2.0 0.604
2.4 0.731
2.8 0.868
 
图4 番茄红素标准曲线
由表3、图4可知，标准曲线的线性回归方程为 y = 0.3125x-0.013，R2
为0.9992，表明线性关系良好。
3.2碳源为变量的发酵培养基对β-胡萝卜素产量的影响
碳源是合成菌体成分的原料，也是微生物获取能量的主要来源。整体上看来，微生物可以利用的碳源范围极广，从大类上说，可以分为有机碳源和无机碳源两大类，一般来说异养微生物能利用有机碳源，而自养微生物则是以利用无机碳源为主。糖类是被微生物所广泛利用的碳源。根据文献资料[18]和实验菌种的特性，选定玉米淀粉作为碳源，将其浓度定制2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%，其它成分为黄豆粉20g/L、植物油35ml/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁1g/L、VB1 0.03g/L、异烟肼12ml/L、β-紫罗酮15ml/L、pH为自然条件。将上述培养基在121℃下灭菌20min。实验数据分析如下图5：
 
注：■  β-胡萝卜素的含量；
 ●  番茄红素的含量；
★  生物量
图5 不同碳源浓度的实验分析图
从2.5%的浓度开始，无论是450nm还是471nm的测得的吸光值转化的类胡萝卜素的含量都有一个很好的递增和下降趋势。当然，也可以明显的看出，在450nm处时3.0%浓度时测得的浓度的含量是最大的，而471nm处则以3.5%浓度时所得数值最大。综合培养后菌体颜色的色泽深度，我们以选取3.0%作为培养基的碳源的最优值。我们也可以通过正态分布图来更好的解释实验的结果,见下表4、图5以及表5、图6：

表4 450nm处碳源结果正态分布表
450nm数据统计 柱数 分组数据 直方图 正态分布图
数据个数 39 1 59  1 1.3E-03
最大值 328  2 104  4 3.6E-03
最小值 59  3 149  12 6.0E-03
平均值 170.1  4 193  10 5.9E-03
标准偏差 62.8  5 238  7 3.5E-03
区间 269  6 283  3 1.3E-03
直方图柱数 7 7 328  2 2.7E-04
直方图组距 45     
 
图5 450nm处碳源结果正态分布图
表5 471nm处碳源结果正态分布表
471nm数据统计 柱数 分组数据 直方图 正态分布图
数据个数 40 1 47  1 5.0E-03
最大值 222  2 76  15 8.9E-03
最小值 47  3 105  9 9.4E-03
平均值 94.1  4 134  8 6.0E-03
标准偏差 40.7  5 163  3 2.3E-03
区间 175  6 193  2 5.2E-04
直方图柱数 7 7 222  1 7.2E-05
直方图组距 29     
 
图6 471nm处碳源结果正态分布图
很明显的，两个不同的强度450nm和471nm下的正态分布曲线都有很好的增减趋势，而且较好的符合正态分布的区域。
结合实验过程和结果分析，我们认为是3%含量的玉米淀粉更加有利于菌体的生长，但相对其他的含量也有高的趋势，3%的稳定性高些，也更能满足我们的需求，所以在以后的发酵实验中，选择3%的玉米淀粉作为碳源。
3.2氮源为变量的发酵培养基对β-胡萝卜素产量的影响
氮源主要是供给合成菌体结构的原料，很少作为能源利用。与碳源相似，微生物作为一个整体来说，能利用的碳源种类十分广泛。某些微生物（如固氮菌）能利用空气中分子态的氮或利用无机氮化物如铵盐、硝酸盐合成有机氮化物。多数致病菌则必须供给蛋白胨、氨基酸等有机氮化物才能生长。根据实验资料和菌种的特性，以3%的玉米淀粉作为碳源，再选定黄豆粉作为本次实验的氮源，将其浓度定制1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%，其它成分为3%的玉米淀粉、植物油35ml/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁1g/L、VB1 0.03g/L、异烟肼12ml/L、β-紫罗酮15ml/L、pH自然条件。上述培养基在121℃下灭菌20min。实验数据分析如下图7：
 
注：■  β-胡萝卜素的含量；
 ●  番茄红素的含量；
★  生物量
图7 不同氮源浓度的实验分析图
我们根据所做的33组实验数据，得出了其中的平均值，并将它们绘制成如上图所示。从图7中，我们可以很直观的看出，在3.0%浓度下，无论是450nm还是471nm强度光下，所测得的吸光度值都是最高的，从而转化为β-胡萝卜素和番茄红素的含量也是最高的。分析认为，3%浓度下的氮源和碳源结合，能够有利于菌体的生长和β-胡萝卜素的产生，这就是我们实验和工业所需求的。也可以通过正态分布图来更好的了解实验的结果,见下表6、图8以及表7、图9：
表6 450nm处氮源结果正态分布表
450nm数据统计 柱数 分组数据 直方图 正态分布图
数据个数 33 1 61  1 1.9E-03
最大值 370  2 123  11 4.3E-03
最小值 61  3 184  6 5.1E-03
平均值 170.2  4 246  10 3.2E-03
标准偏差 76.2  5 308  3 1.0E-03
区间 309  6 370  1 1.7E-04
直方图柱数 6    
直方图组距 62     
 
图8 450nm处氮源结果正态分布图
表7 47 1nm处氮源结果正态分布表
471nm数据统计 　 柱数 分组数据 直方图 正态分布图
数据个数 33 1 21  1 5.1E-03
最大值 138  2 45  11 1.2E-02
最小值 21  3 68  6 1.4E-02
平均值 61.6  4 91  10 8.2E-03
标准偏差 28.1  5 114  3 2.4E-03
区间 116  6 138  1 3.7E-04
直方图柱数 6    
直方图组距 23  　 　 　 　
 图9 471nm处氮源结果正态分布图
很明显的，两个不同的强度450nm和471nm下的正态分布曲线都有很好的增减趋势，而且较好的符合正态分布的区域，也就证明了实验数据的可靠性。
结合实验过程和结果分析，我们认为是3%含量的玉米淀粉和3%含量的黄豆粉结合使用能很好的促进菌体的生长和β-胡萝卜素的产生。所以在以后的发酵实验中，选择3%的黄豆粉作为氮源。
3.3 pH为变量的发酵培养基对β-胡萝卜素产量的影响
三孢布拉氏霉菌的生长状况在不同pH的发酵培养基中是有所不同的，为了进一步考察三孢布拉氏霉菌的代谢环境对β-胡萝卜素的产量是否有所区别，设计了此次方案。古勇[10]等人认为，三孢布拉霉氏菌在pH值6.0左右处于较好的生长状态，但β-胡萝卜素在不同pH值其稳定性不同，而在碱性条件下相对较为稳定。而在各种文献中[16]，由于培养基的pH值与菌种、培养基的组成有关，同时，不同的菌株和不同的培养基组成，对其最适pH的适应也会有一定的差别。在本实验设计中，选择培养基在灭菌前将其pH值调节至在6.0--10.0范围，从而观察其对β-胡萝卜素的产量的影响。实验数据分析如下图10所示：
 
 注：■ 番茄红素的含量；
      ● β-胡萝卜素的含量；
★  生物量
图10 不同pH条件下实验数据结果分析
根据实验所做的38组数据，得出了它们的平均值，并将其绘制成如上图所示。从图10中，可以很直观的看出，在pH为7的时候，450nm处和471nm处的吸光度，从而可以认定其产生的β-胡萝卜素含量也是最高的。虽然在pH8之后有一个上升趋势，但是，我们也必须考虑到菌种适合的pH环境。若将pH调制11以致更高时，菌种本身也不能很好的存活，同时产生的产物也需经过严格的筛选和鉴定。基于上述原因以及实验中菌体颜色的深浅度，我们可以认为在pH=7时的培养环境更加适合三孢布拉氏霉菌的生长和β-胡萝卜素的产生。当然也可以通过正态分布图来更好的解释实验的结果,见下表8、图11和表9、图12：
表8 450nm处不同pH正态分布表
450nm数据统计 柱数 分组数据 直方图 正态分布图
数据个数 38 1 43  1 1.8E-03
最大值 344  2 93  8 3.6E-03
最小值 43  3 143  12 4.9E-03
平均值 156.1  4 193  6 4.4E-03
标准偏差 80.9  5 244  4 2.7E-03
区间 302  6 294  5 1.2E-03
直方图柱数 7 7 344  2 3.3E-04
直方图组距 50     
 
图11 450nm处不同pH正态分布图
表9 471nm处不同pH正态分布表
471nm数据统计 柱数 分组数据 直方图 正态分布图
数据个数 39 1 17  1 5.1E-03
最大值 129  2 36  9 1.0E-02
最小值 17  3 54  11 1.3E-02
平均值 58.1  4 73  5 1.2E-02
标准偏差 29.5  5 92  5 7.1E-03
区间 112  6 110  5 2.8E-03
直方图柱数 7 7 129  2 7.7E-04
直方图组距 19     
 
图12 471nm处不同pH正态分布图
很明显的，两个不同的强度450nm和471nm下的正态分布曲线都有很好的增减趋势，而且较好的符合正态分布的区域，也就证明了实验数据的可靠性。
结合实验过程和结果分析，我们认为是pH为7的环境更能满足菌种的生长和繁殖需求。因此，在接下来的实验中，我们都以pH为7作为基准进行实验。
3.4添加表面活性剂来测定对产量的影响
根据微生物生理学和代谢的表达特性，微生物在发酵液中的菌体形态，可以分为：菌丝球聚集体、粗糙菌丝球、平滑菌丝球、菌丝块、分散菌丝体。而相对的来说，丝状真菌在液体培养基中的菌体形态对发酵生产有非常重要的影响。有研究表明[18]，菌丝的形态会受到菌株内外两方面的因素的影响，比如表面活性剂的添加就会对三孢布拉氏霉发酵产β-胡萝卜素的研究发酵的菌体形态造成影响，进而影响菌体的生长和代谢，影响代谢产物的生成。因此，此次方案以司班20、司班40、吐温80、OP乳化剂四种不同的表面活性剂的0.5‰、1.0‰的不同的含量来考察对β-胡萝卜素产量的影响。实验结果数据如下图13、图14：
 
图13 不同种类的表面活性剂的生物量
 
图14 不同种类的表面活性剂实验结果分析
根据所做的38组实验数据，得出了它们的平均值，并将其绘制成如上图所示。从图中，我们可以很直观的看出，OP乳化剂的含量为0.5‰时所得的吸光度是最大的，所以转化的β-胡萝卜素含量也是最高的，再从图13中可以发现，虽然它的生物量在司班40. 0.5‰的下面，但是综合其它因素，0.5‰的OP乳化剂的含量相对于其它的含量而言是最好的，可能的原因是OP乳化剂的添加改变了发酵的菌丝形态，从而影响了菌体的生长和产物的合成。当然，正态分布曲线图表亦能很好的帮助我们了解实验的可靠性和准确性。具体数据见如下表10、图15和表11、图16：
表10 450nm处不同表面活性剂结果正态分布表
450nm数据统计 柱数 分组数据 直方图 正态分布图
数据个数 69 1 59  1 1.5E-03
最大值 480  2 112  11 3.6E-03
最小值 59  3 164  20 5.2E-03
平均值 178.6  4 217  16 4.7E-03
标准偏差 75.3  5 270  14 2.6E-03
区间 421  6 322  4 8.6E-04
直方图柱数 9 7 375  1 1.8E-04
直方图组距 53  8 427  1 2.3E-05
  9 480  1 1.8E-06
 
图15 450nm处不同表面活性剂结果正态分布图
表11 471nm处不同乳化剂正态分布结果图表
471nm数据统计 柱数 分组数据 直方图 正态分布图
数据个数 69 1 22  1 3.7E-03
最大值 121  2 35  7 8.0E-03
最小值 22  3 47  10 1.3E-02
平均值 63.4  4 59  14 1.7E-02
标准偏差 23.6  5 72  11 1.6E-02
区间 99  6 84  8 1.2E-02
直方图柱数 9 7 96  12 6.4E-03
直方图组距 12  8 109  1 2.7E-03
  9 121  1 8.5E-04
 
图16 471nm处不同乳化剂正态分布结果图
450nm处和471nm处的正态分布曲线图让我们了解了在不同的吸光强度下，不同的乳化剂的最优分布效果。在后续的实验中，我们将添加0.5‰的OP乳化剂来继续实验的进程。

4. 总结与展望
发酵培养基是用于生产预定发酵产物的培养基，是供菌体生长、繁殖和合成产物之用。它既要使种子接入培养基后能迅速生长，达到一定的菌体浓度，更重要的是使长好的菌体能迅速合成所需产物。我们对培养基成分进行初步确定，以达到最大量的发酵最终产物β-胡萝 卜素。以β-胡萝卜素的发酵产量作为监测的主要指标，菌体的干重为参考指标选择发酵培养基。为进一步培养条件的优化提供基础。
影响三孢布拉氏霉菌产生β-胡萝卜素的产产量的因数很多，本实验通过对其中几个主要因数（碳源、氮源、pH、表面活性剂）进行了研究，得出使得其产量最高的发酵培养基的成分：玉米淀粉碳源3%、黄豆粉氮源3%、pH 为7.0、表面活性剂为OP乳化剂的0.5‰。
当然该实验的发酵水平与目前工业化生产上有差距，在菌丝体生物量、β-胡萝卜素的产量较低，原因主要是受实验条件所限制，可以在进一步的实验中细化各影响因素，并广泛摸索更多未涉及到的可能对发酵产生影响的因素，并进一步提高其产量。
三孢布拉氏霉菌的发酵工艺复杂，不稳定，产量低是目前存在的主要问题，解决好发酵工艺，细胞破碎技术及高效提取纯化技术是能否工业化的技术前提。

致    谢

本课题在选题及研究过程中得到戴德慧老师、胡伟莲老师的悉心指导。戴老师多次询问研究进程，并为我指点迷津，帮助我开拓研究思路，精心点拨、热忱鼓励。戴老师一丝不苟的作风，严谨求实的态度，踏踏实实的精神，不仅授我以文，而且教我做人，将给我以终生受益无穷之道。同时，在此次毕业设计过程中我也学到了许多了关于微生物方面的知识，实验技能有了很大的提高。
另外，我还要特别感谢胡老师对我实验以及论文写作的指导，为我完成这篇论文提供了巨大的帮助。我还要感谢我们实验室的每位成员，感谢大家的配合，与相互帮助以及他们对我的理解和支持。
写到这里，即我的学位论文将要付梓的时候，我四年的大学生活也即将划上句号。在这里我要感谢，感谢陪我走过陪我经历这一切的所有的朋友、同学、老师、父母。感谢你们对我的帮助；感谢你们给我的教导，感谢你们给我的温情。当然，还要感谢我的母校----浙江科技学院。
四年时间转瞬即过，回首往事感慨万千。本科阶段只是我追求的开始，在以后的日子里我会更加勤奋的工作，努力去征服一个个的困难，实现我人生的梦想。
    最后，再次谢谢所有帮助过我的人们，谢谢……

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