基于壳聚糖/Ru( bpy) 3+ /SiO2纳米粒子 电化学发光传

　　1引言

　　尿酸是核蛋白和核酸的代谢产物’人体内尿酸过量是许多疾病的征兆’如痛风、肾功能衰竭、心血管疾病等，故人体内尿酸的检测在临床诊断方面有着重要意义。目前,测定尿酸的方法主要有色谱法、分光光度法、荧光法、化学发光法、电化学法等。

　　电化学发光因其设备简单、灵敏度高、适用范围广等特点而备受关注。但是目前利用电化学发光法测定尿酸的方法较少。近年来,通过将发光试剂固定在电极表面制备得到固相电化学发光传感器’这样既节约了昂贵的发光试剂，又提高了灵敏度,拓宽了电化学发光法在分析化学中的应用。溶胶-凝胶膜法和Nafon/MCNT是目前应用最多的固定化技术，但是溶胶-凝胶法制备的电化学发光传感器稳定性较差。利用二氧化硅微球包埋联吡啶钌，可以改善Si02溶胶-凝胶法固定联吡啶钌传感器的稳定性。壳聚糖分子中含有丰富的游离氨基和羟基,具有良好的吸附能力、导电能力和生物相容性,是电化学发光传感器中较优良的材料。

　　本研究利用反相微乳液法制备得到壳聚糖-Ru(bpyg+-Si02复合纳米粒子（CRuSNPs)，带正电荷的CRuSNPs与带负电荷的Nafion通过静电作用自组装固定于玻碳电极表面，制备了电化学发光传感器。此传感器具有良好的稳定性和重现性，用于尿酸的免标记检测，结果令人满意。与临床上测定尿酸的方法相比’本方法简单、试剂用样量少、选择性好。

　　2实验部分

　　2.1仪器与试剂

　　MPI-E型电致化学发光分析系统（西安瑞迈电子科技有限公司），Zennium电化学工作站（德国Zah-ner公司），UV-1600PC紫外-可见分光光度计（中国上海美谱达仪器有限公司），F-4600荧光分光光度计(日本日立公司），RT5POWER电磁搅拌机（德国IKA公司），WF-300D超声波清洗机（宁波海曙五方超声设备有限公司），TDL-802B型离心机（上海安亭科学仪器厂），PT-RO10L实验室超纯水设备（上海品拓环保工程设备有限公司）。三电极系统:工作电极为裸玻碳电极或修饰电极,Pt丝为对电极,Ag/AgCl(饱和KCl溶液）为参比电极。

　　多壁碳纳米管（MCNT,中国科学院成都有机化学有限公司，>7.5%,7?15nmX0.5?10pm.);壳聚糖（於呢=60000~120000g/mol，乙酷化度在40mol%)、三联吡啶钉、Nafion117、正硅酸乙酉旨、TritonX-100、正己醇、环己烷均购于Sigma公司；尿酸（天津市华东试剂厂）；其余试剂均为分析纯。

　　0.5%壳聚糖溶液由1%冰醋酸溶液配制而成。0.01mol^LRu(bpy)3+由0.1mol/LPBS溶液(pH7.4)配制而成。Nafion/MCNT的配制：准确称取0.05g碳纳米管分散于60mL2.2mol/LHNO3中，超声30min后，室温放置20h，然后用超纯水洗至中性，在37°C烘箱中烘干。准确称取纯化后的碳纳米管1.5mg于4mL离心管中，加人30|xL0.05%Nafion2.97mL无水乙醇摇勻。实验用水为超纯水。2.2CRuSNPs的制备

　　分别取7.5mL环己烷、1.8mLTrionX-100和正己醇混合，加人300^L超纯水为分散相，搅拌0.5h后，依次加人50吣0.01moL/L三联吡啶钌和150^L0.5%壳聚糖溶液形成稳定的油包水结构，并加人适量NaOH溶液，将体系调为中性，然后持续搅拌1h，依次加人90^L正硅酸乙酯、60^L氨水，再持续搅拌24h，反应完全后，加人6mL丙酮破乳，离心收集复合纳米粒子，然后分别以乙醇、超纯水超声离心，吸取上清液得复合纳米粒子，最终将其分散在NaAc-HAc缓冲溶液（pH5.0)中，2°C保存。

　　2.3电化学发光传感器的制备

　　将玻碳电极（直径2mm)在0.05pmA^Og抛光粉上打磨光亮，分别在HNOg(1:1，K/K)，乙醇（1:1，V/V)，超纯水中超声3min，干燥后。取10^LNafion/MCNT混合液滴加于干净的玻碳电极表面，自然晾干。将修饰好的电极插人200^L均匀的CRuSNPs溶液中30min，CRuSNPs复合纳米粒子通过静电吸附随时间逐渐自组装于Nafion/MCNT电极表面，随后用0.01mol/LPBS(pH7.4)冲洗电极，去除非特异性吸附的CRuSNPs纳米粒子，随后，用循环伏安技术将CRuSNPs/Nafion/MCNT电极在0.9?1.4V的电位窗口下扫描至稳定，除去电极表面多余的Ru(bpy)3；+，最终可制得电化学发光传感器。图1为电化学发光传感器的原理图。

　　2.4实验方法

　　以CRuNPs/Nafion/MCNT/GCE修饰电极为工作电极，当电解池中的尿酸与修饰电极作用15min后，在~0.2?1.4V范围内进行循环伏安扫描，扫描速率为100mV/s，介质为0.10mol/LPBS缓冲溶液(含50mmol/LTPA，pH7.4)，光电倍增管负高压为800V，记录电化学发光信号，通过电化学发光强度值对尿酸进行定量分析，所有实验均在室温下进行，所有电位值均相对于Ag/AgCl参比电极。

　　3结果与讨论

　　3.1CRuSNPs的表征

　　对合成的CRuSNPs进行了TEM表征（图2)，由图2可知，所制备的纳米颗粒的平均直径为50nm且分散效果较好。CRuSNPs的紫外和荧光光谱图见图3。由图3A可知，合成的CRuSNPs复合纳米粒子与游离态的Ru(bpy)23+紫外吸收光谱形状相同，可知CRuSNPs在水溶液中具有很好的分散性。由图3B可知，在458nm激发波长下，游离态的Ru(bpy)〗+最大发射波长为596nm，而CRuSNPs的最大发射波长较Ru(bpy)]+蓝移了17nm，这可能是因为CRuSNPs溶液中的SiO-基团与Ru(bpy)〗+之间的静电吸附使得Ru(bpy)2/被束缚在SiO〗纳米粒子内部，致使CRuSNPs在溶液中时，很少与周围的水分子相互作用，显示出荧光发射波长相对较短[18]。

　　3.2传感器的电化学及电化学发光行为

　　实验对不同电极表面进行了电化学及电化学发光行为进行研究。由不同电极在0.1mol/LPBS(pH7.4)中循环伏安图（图4A)可见，Nafion/MCNT修饰电极（曲线b)的电流强于裸玻碳电极(曲线a)，这是因为MCNT具有较强的导电性，说明Nafion/MCNT已修饰于玻碳电极上，而CRuSNPs/Nafion/MCNT修饰电极（曲线c)的电流强于Nafion/MCNT修饰电极（曲线b)，这是因为CRuSNPs纳米粒子具有较大的比表面积，电子传导能力增强，且由曲线c还可看出，在+1.1V处出现可逆的氧化还原峰，这正是Ru(bpy)3+的特征峰，说明CRuSNPs已成功修饰于Nafion/MCNT上。

　　由不同电极在50mmoL/LTPA(0.1moL/LPBS，pH7.4)中的电化学发光图（图4B)可知，裸电极（曲线a)和Nafion/MCNT修饰电极（曲线b)几乎不发光，但将CRuSNPs纳米粒子固定在Nafion/MCNT修饰电极上时，出现明显的发光现象（曲线c)，这表明CRuSNPs已很好地固定在Nafion/MCNT电极表面，从而显示出良好的电化学发光行为。

　　稳定性和重现性对于构建可重复使用的修饰电极至关重要。由CRuSNPs/Nafion/MCNT修饰电极连续扫描电化学发光图（图4C)可见，Nafion/MCNT与CRuSNPs混合膜修饰电极在连续扫描10圈的过程中，电化学发光信号非常稳定。

　　3.3尿酸在CRuSNPs/Nafion/MCNT修饰电极上的电化学发光行为

　　考察了尿酸在CRuSNPs/Nafion/MCNT修饰电极上的电化学发光行为。如图5所示，当在0.10moVLPBS(含50mmoVLTPA，pH7.4)中加入1.0X10-7moVL尿酸时，电化学发光强度降低，证明尿酸对CRuSNPs/Nafion/MCNT修饰电极上Ru(bpy)23+的电化学发光有抑制作用。众所周知，对于Ru(bpy)2+-TPA电化学发光体系，Ru(bpy)〗+被电氧化为Ru(bpy)3+，而TPA被电氧化为TprA-+，从而形成TprA-自由基，Ru(bpy)33+和TprA-反应得到Ru(bpy)2+#，Ru(bpy)2+#从激发态返回至基态便产生电化学发光。尿酸对该电化学发光体系的猝灭原因可能是由于尿酸的加入，消耗了部分Ru(bpy)3/所致。

　　3.4实验条件的选择

　　CRuNPs中的羟基能与尿酸中的胺基形成氢键，故CRuNPs/Nafion/MCNT/GCE修饰电极与尿酸的作用时间及体系的pH值均对电化学发光强度有一定的影响。由图6可知，随着反应时间延长，电化学发光信号逐渐降低，到15min时发光强度趋于平稳，再继续延长结合时间，响应信号几乎不变。这表明15min时即可达到猝灭最大程度，因此选择15min作为反应时间。实验考察了1.0X10-7mol/L尿酸在pH5.8?8.0范围内的电化学发光现象。结果表明，随着pH值增大，抑制效果先增大后减小，当pH=7.4时，抑制效果最大。因此选择pH7.4的缓冲溶液进行后续实验。

　　3.5干扰实验

　　在最佳实验条件下，当尿酸浓度为1.0X10-7mol/L，相对误差不超过±5%时，1000倍的K+，Na+，Fe2+，Zn2+，Ca2+，Mg2+，Cl-；500倍的葡萄糖、尿素、蔗糖；100倍的L-谷氨酸、L-赖氨酸、羟脯氨酸、抗坏血酸不干扰测定；50倍的草酸干扰测定，实验采取加入Ca2+消除干扰。

　　3.6传感器对尿酸的电化学发光响应

　　在优化实验条件下，按实验方法测定不同浓度尿酸电化学发光强度并绘制工作曲线（图7)。电化学发光强度和尿酸浓度（1.0x10-10?1.0x10_5mol/L)的负对数呈良好的线性关系，线性方程为:1ECL=-709.52-202.

　　3.7传感器的重现性和稳定性分析

　　用同一支传感器对1.0X10-8mol/L尿酸连续测定11次，电化学发光强度相对偏差为2.9%，用同一批次的5支传感器对1.0X10-8mol/L尿酸进行测定，电化学发光强度相对偏差为3.1%，说明此传感器有较好的重现性。为考察传感器的稳定性，使传感器吸附1.0X10-8mo^L尿酸溶液后，置于4T下保存，定期测定电化学发光信号值。14天内，电化学发光强度几乎不变，说明传感器的稳定性较好。

    3.8样品测定

　　取3份新鲜尿液0.5mL于50mL容量瓶中，加人1.00mL0.01mol/LCaCl2以除去C2O〗，用高纯水定容，再将该溶液稀释1000倍，以此为分析样品，按照实验方法进行测定，同时，进行加标回收实验，测定结果见表1。加标回收率为98.5%?103.5%，RSD为2.3%?3.1%，表明本方法可用于实际样品的测定。

　　表1尿液样品分析及回收率实验

　　4结论

　　采用Nafion/MCNT复合膜技术，实现了对壳聚糖-Ru(bpy)丨+-SiO2纳米粒子有效而稳定的固定，成功制备了电化学发光传感器。通过对Ru(bpy)3+的固定，实现了Ru(bpy)〗+的循环使用，降低了分析成本并提高了灵敏度。此传感器制备方法简单、价格低廉、用样量少、用于尿酸的免标记检测，结果令人满意。