Coriolus versicolor固体发酵产漆酶的研究

摘　要：研究云芝固体发酵产漆酶的营养条件和培养条件，得出较好的培养基组成：固体发酵基料选择麸皮与花生壳，其合适的比例为1：1，液体营养盐中葡萄糖浓度为0.5%，培养基含水率为70%，初始pH为2.0，接种量为20%、培养温度为30℃。通过对产酶条件的优化，优化后的漆酶的最高酶活力是优化前的4.1倍，杂色云芝在该条件下产漆酶，达到最高酶活需要10天，并且最高酶活可以维持3~4天。

关键词：杂色云芝；固体发酵；漆酶；发酵基料

　　漆酶最早是在漆树的汁液中发现的，故将其命名为漆酶。漆酶广泛存在大量植物、真菌中。分泌漆酶的真菌主要集中于担子菌亚门(Basidiomycotina )、子囊菌亚门(Ascomycotina)及半知菌亚门(Deuteromycotina)等高等真菌，其中最主要的是担子菌亚门的白腐真菌。漆酶在食品工业、造纸工业、环境保护等领域中具有广泛应用，Pertersen利用漆酶中铜离子的催化特性，除去色拉、蛋黄酱等食品中溶解的氧，消除了食品中的亚麻酸和溶解氧反应生成的挥发性异味组分。Jujiop通过研究发现，用漆酶对木材中的木质素进行处理，可以节省30%的动力。
　　本实验选用杂色云芝为菌种，着重研究杂色云芝固体发酵产漆酶的营养条件和培养条件，从而提高漆酶的活力，使漆酶能得到高效的应用。
1材料与方法
1.1菌种
　　杂色云芝菌(Coriolus versicolor)，南京林业大学微生物技术实验室保藏。菌丝体于4℃保存在PDA斜面培养基上。
1.2基本培养基
　　（1）固体斜面培养基（g/L）：马铃薯200；葡萄糖20；琼脂20。
　　（2）固体发酵培养基（/瓶）：麸皮5g；花生壳5g；液体营养盐23 mL；吐温80 2滴。
　　（3）液体营养盐的配制（/L）：葡萄糖5g；(NH4)SO4；KH2P043g；MgS04·7H2O O.5g；愈创木酚4g；CaCl22g；CuSO40.6mg；0.2mol/L pH5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液100mL；微量元素浓缩液1mL。
　　（4）微量元素浓缩液的配制（g/L）：MnSO4  0.3；FeSO4·7H2O 3；ZnSO4·7H2O 0.3；VB1 0.1。
1.3 培养基中漆酶酶活的测定：
　　在3mL总反应体积中，含有0.5mmol/L底物[2，2 -连氮-二-（3 - 乙基苯并噻唑-6-磺酸）简称ABTS 1mL，50mmol柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和酶液共计2mL。将缓冲液和ABTS在50℃水浴保温5min后，立即用移液枪添加适量酶液，并同时开始计时，分别测定1min, 2min, 3min时420nm处吸光值。定义每分钟氧化1μmolABTS所需酶量为一个酶活单位（U）。
　　液体酶活计算方法：液体酶活力（U/L）= △OD×V1/( V2×t×ε)
　　式中： △OD：吸光度增加值；t：间隔时间（min）；V1：总反应体积（mL）
　　V2：酶液体积；ε：消光系数（M-1 cm-1）[ε420= 36000 ×10－6 M-1cm-1]
　　固体酶活计算方法：固体酶活（U/g原料）=液体酶活力（U/L）×M1×M2
　　式中： M1：提酶时固体基质（g）与所用的缓冲液（L）的比值
               M2：发酵以后固体基质的湿重（g）与固体原料的重量（g）的比值
1.4蛋白含量的测定方法：
　　采用改良的Bradford法测定
1.5发酵方法
　　将C. versicolor菌种从PDA培养基上刮到无菌水中，用匀浆机打碎菌丝体，开低档，时间约4s。用移液管吸取3mL菌丝体悬浮液于固体培养基中，在无菌条件下用玻璃棒搅拌均匀。放置在30℃恒温培养箱内培养，并保证一定湿度，培养10天左右。
1.6固体酶曲中漆酶的提取
　　称取1g湿曲，加入49 mL柠檬酸缓冲液并充分搅匀，40℃下提取1h。然后将浸泡液于10000rpm, 4℃条件下离心5 min，得上清液即初酶液。
2 结果与讨论
2.1最佳固体发酵基料的确定
　　选用稻草、甘蔗渣、玉米芯、玉米皮、花生壳等纤维废弃物为固体发酵产漆酶的发酵基料，各称取5g放入250ml的三角瓶中，加入5g麸皮、23 mL液体营养盐和2滴吐温80，在30℃的恒温培养箱中培养16天，结果见图1。

                  图1 不同纤维原料对产酶的影响
　　由图可知，以花生壳为原料时，云芝分泌漆酶的活力最高（46.4U/g原料)，并且周期较短，达到最高酶活时仅需要8天。这是因为花生壳结构比较疏松，里面的营养物质更容易被菌丝体利用，而且发酵过程中透气性较好。玉米芯也具有与花生壳类似的特点，所以产酶活力也比较高，仅次于花生壳，但是达到最高酶活力的时候比花生壳要多两天。稻草是常见的农业废弃物，但是利用稻草固体发酵产漆酶时，菌体生很缓慢，漆酶分泌量也很少，这可能是因为稻草表面有蜡质，C. versicolor菌丝不能吸收稻草中的营养物质，因而也就不利于菌体产酶。
2.2麸皮和花生壳最佳比例的确定
　　麸皮与上述五种纤维原料有所不同，除了能够提供必要的碳氮源，还可以为漆酶合成提供丰富的微量元素和生长因子。经过对发酵基料的比较，花生壳的产酶效果相对较好，因此，在确定花生壳作为发酵基料的基础上，着重考察麸皮与花生壳按不同配比混合后，云芝产漆酶的情况。选取11个不同的麸皮与花生壳的比例水平，培养12天，从第6天开始每天取样，选取第6天、第8天、第10天的数据进行比较分析，结果见图2。 
　　在实验过程中，固体基质采用全麸皮的时候，菌丝体生长旺盛，但是漆酶产率较低；固体基质采用全花生壳时虽然菌丝体生长比全麸皮时生长缓慢，但是其漆酶产率比麸皮要高。由此可以看出，麸皮有利于菌丝体生长，花生壳有利于后期的产酶。由图2可知，麸皮和花生壳比例为1:1时，产酶周期较短，漆酶酶活最高为86.6U/g原料。

                         图2 麸皮和花生壳比例对产漆酶的影响
2.3液体营养盐中葡萄糖浓度的确定
　　葡萄糖是微生物较容易利用的单糖，本实验以5g麸皮，5g?花生壳为原料，在30℃下培养一定时间，比较葡萄糖浓度对云芝产漆酶的影响。液体营养盐中葡萄糖浓度选用了5个浓度水平：0%、0.25%、0.5%、075%、1%，在第6天，第8天，第10天测酶活，其结果如图3所示。

　　

                图3 液体营养盐中葡萄糖浓度对漆酶形成的影响
　　由图可知，液体营养盐中葡萄糖浓度以0.5%为宜，在第8天时达到最高酶活（33.5U/g原料），在菌体前期生长过程中，培养基中添加一定量的葡萄糖有利于菌体生长，对漆酶的形成有利，而添加的葡萄糖过多时，菌体生长过旺，消耗大量的营养成分，不利于后期漆酶的形成。
2.4培养基中水分含量的确定
　　实验以5g麸皮和5g花生壳为发酵基料，液体营养盐中葡萄糖浓度为 0.5%，选取6个含水量浓度水平：50%、55%、60%、65%、70%、75，在30℃的恒温培养箱中培养12天，在第6天，第8天，第10天测酶活，比较不同含水率对

产漆酶的影响，结果如图4所示。
　　由图可知，当培养基的含水率小于70%时，随着培养基含水率的增加，云芝产漆酶的酶活力逐渐升高，因为在一定范围内，初始含水量越高，固体基质内水活度越高，当含水率为70%时漆酶酶活力达到最高（52.5U/g原料），是50%时的3.24倍。发酵培养基的初始含水量为75%时的酶活低于70%，可能的原因是含水率太高影响热量的散失，从而影响漆酶的分泌。
　　
　                    　图4 培养基含水率对产漆酶的影响
2.5固体发酵培养基中最佳pH的确定
　　根据上面优化的条件组成新的培养基，采用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液将固体发酵培养基的初始pH调为6个水平： pH2.0、pH 3.0、pH 4.0、pH 5.0、pH 6.0、pH 7.0，在30℃条件下培养12天，结果如图5、图6所示。
　　由图5可知，培养基的初始pH不同对产漆酶没有太明显的影响，但前期的pH越低越不利于杂菌的生长，从这个角度来考虑，初始pH偏低有利于抗杂菌因此选用初始pH值在2.0左右比较适宜。

                图5 培养的的初始pH对产漆酶的影响
2.6最佳接种量的确定
　　接种量也是影响微生物的生长和产物合成的主要因素之一。接种量小，微生物生长缓慢，培养周期延长；接种量多，微生物生长迅速，在培养初期可能引起溶氧不足而改变代谢途径，从而导致产物形成减少。不同接种量对云芝合成漆酶的影响如图6所示。由图可知，接种量在5~15%时，漆酶酶活力随着接种量的增加而增大，当接种量为20%时，酶活力达到最高值135.3U/g原料，之后随着接种量的增加，漆酶的酶活力没有太明显的变化，但接种量过大，给种子的扩大培养带来困难。因此选用20%为最佳接种量。

                         图6 接种量对产漆酶的影响
2.7最佳培养温度的确定
　　温度是影响微生物生长繁殖的重要因素之一，从酶反应动力学来看，温度越高，生长代谢加快，但是温度过高，会导致酶的活力下降。

                    图7 温度对漆酶合成的影响
　　将麸皮与花生壳比例为1：1，培养基含水率为70%，接种量为 20%的固体培养基，分别置于26℃、28℃、30℃、32℃下培养10天，取样测定各样品的漆酶活力。结果如图7所示。由图可知，云芝固体发酵合成漆酶的最适温度为30℃，此时酶活力为139.1U/g原料；在32℃时，菌体生长缓慢，酶活力偏低；在26~30℃范围内，酶活力随着温度的升高而增加；在30℃的条件下，第10天时的酶活是139.1U/g原料，是26℃的1.60倍，是32℃的1.61倍。实验结果与张树江等人的研究结果相同。
2.8云芝产漆酶发酵产酶历程
　　以1：1麸皮与花生壳为发酵基料，在葡萄糖浓度为0.5%，含水率70%、接种量20%、初始pH 2.0、30℃的条件下培养10天，培养过程中各参数随时间的变化规律如图 9所示。

                  图8 云芝产漆酶固体发酵历程
　　由图可以看出，pH呈现先下降后上升的趋势，可能因为发酵初期，氮源是硫酸铵，硫酸铵的利用使得pH下降；后期随着发酵的进行，pH值上升。由图还可以看出，发酵前4天内，菌体处于生长阶段，几乎不产漆酶。之后随着培养的进行，漆酶的合成量不断增加，在第10天是达到最大酶活103.4U/g原料。
　　
参考文献：
[1] 尹亮, 陈章和, 赵树进. 白地霉产漆酶条件优化及对偶氮染料的脱色[J]. 华南理工大学学报(自然科学版), 2008, 12 (36) :85-90.
[2] 许 颖, 兰 进. 真菌漆酶研究进展[J]. 食用菌学报, 2005, 2 (1) : 57-64.
[3] Jujop. Enzymes are breaking into paper[J]. Pulp and Paper Int, 1991, 33 (9) :81.
[4] 赵树江. 固态发酵产漆酶及其应用基础研究[D]. 杭州:材化学院生物化工系, 2006.