dna甲基化检测方法论文

建议高人来指导下

为什么要检测 DNA 甲基化？ 首先，我们为什么要检测 DNA 甲基化呢？检测 DNA 甲基化能回答什么问题？我们都知道，DNA 甲基化可以调控基因表达，因此检测 DNA 甲基化至少可以为解释基因表达的调控提供一些线索。其次，DNA 甲基化参与一系列重要生物学过程，包括早期胚胎发育、基因组印记、X 染色体失活、重复序列的沉默以及癌症的发生发展转移，DNA 甲基化也有助于阐明这些重要的生命过程背后隐藏的奥秘。此外，DNA 甲基化一个非常重要的应用，是可以作为肿瘤的生物标志物。DNA 甲基化如此重要，我们可能需要时刻想着它。

图 2. 人类基因组中 DNA 甲基化概况

位点特异性的 DNA 甲基化 刚才我们介绍了总体 DNA 甲基化水平的检测，但是这些方法都没有提供序列信息。如果我们需要知道位点特异性的甲基化信息，这个时候需要问第二个问题，我是只检测感兴趣的几个基因就行了，还是需要知道全基因组每一个基因的甲基化状态。如果我们只需要检测特定基因的 DNA 甲基化状态，紧接着，我们需要问第三个问题，我们只是定性地看看甲基化状态，还是定量地看甲基化的水平。

图 13. 四个问题 2.0 版本之第二、三个问题 Methylation-specific PCR，MSP 如果只是定性地看甲基化的状态，最简单快捷的是甲基化特异性的 PCR。MSP 可以快速检测 CpG 岛中任意一组 CpG 位点的 DNA 甲基化状态。

图 16. 重亚硫酸盐转化&克隆测序[7]

基于高通量测序的全基因组 DNA 甲基化检测方法 接下来，我们看一下第四个问题的另一种答案，我们用高通量测序来检测全基因组的 DNA 甲基化。之所以最后讲这个，是因为这个比较烧钱，而且后续的生物信息学分析比较复杂。 WGBS & RRBS 对于二代测序的方法，WGBS（Whole-Genome Bisulfite Sequencing）是目前的“金标准”。WGBS 想必大家都已经很熟悉了，但是考虑到 WGBS 成本较高，因此还有一种跟 WGBS 十分相似，但是只测基因组中的一部分的方法，即 RRBS（Reduced representation bisulfite sequencing）。

图 21. WGBS & RRBS 的比较[10]两者的差别在于，WGBS 通常使用超声打断整个基因组，并对整个基因组进行重亚硫酸盐处理和测序；但是 RRBS 使用 MspI 限制性内切酶。RRBS 可以检测到人类基因组中 85% 的 CpG 岛。RRBS 大约需要 100ng-1ug 的 DNA，而对于 WGBS 而言，需要 50-100ng DNA。尽管 WGBS 被誉为检测 DNA 甲基化的“金标准”，但是依然存在很多的不足。首先，重亚硫酸盐必须转化未甲基化的 DNA，否则会造成假阳性，不过目前我们可以通过加入 spike-in 作为对照来克服这个问题；还有，目前测到的 DNA 甲基化是多个细胞的平均甲基化状态，单细胞的 DNA 甲基化检测可能克服这个问题；其次，重亚硫酸盐转化，会降低基因组的复杂度，造成后续的 mapping 率不高；重亚硫酸盐转化还可能造成 DNA 断裂，这使得扩增长片段比较困难。另外，WGBS 的成本还是非常高的。

参考资料：