HPLC法测定阿莫西林颗粒剂的含量及有关物质

作者：洪建文 李趣嫦 王彦蝶

【摘要】 目的 建立阿莫西林颗粒剂中阿莫西林的含量测定及有关物质检查的方法。方法 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.05 mol/l磷酸二氢钾溶液（ph值5.0）乙腈（体积比97.5∶2.5）为含量测定的流动相；以0.05 mol/l磷酸二氢钾溶液（ph值5.0）乙腈（体积比99∶1）为流动相a， 0.05mol/l磷酸二氢钾溶液（ph5.0）乙腈（体积比80∶20）为流动相b，梯度洗脱检查有关物质，检测波长230 nm，柱温30 ℃，流速 1.0 ml/min。结果 阿莫西林分别在0.1～1 mg/ml(r=0.999 9，n=7)与0.049～0.0012 mg/ml(r=0.999 8，n=5)范围内与峰面积线性关系良好，低、中、高3个浓度的回收率分别为100.2%、99.8%和100.0%(rsd=0.2%，n=9)。阿莫西林有关物质检查的检测限为2 ng，且主成分与有关杂质均能有效分离。结论 本文建立的含量测定方法快速、准确、重现性好，有关物质检查方法专属、灵敏，可用于阿莫西林颗粒剂的质量控制。

【关键词】 阿莫西林颗粒剂 含量测定 有关物质 高效液相色谱法

阿莫西林颗粒剂是香港联邦制药厂有限公司产品，是广谱半合成青霉素类抗生素，具有疗效好、不易致过敏等优点，广泛应用于儿童呼吸系统、泌尿生殖系统、消化系统感染。阿莫西林颗粒剂现行质量标准为进口药品注册标准。该标准采用选择性较差，影响因素较多，试剂配制繁杂且有一定毒害，操作步骤也较繁琐的紫外分光光度法进行含量测定，未进行有关物质的检查。该制剂在《国家药品标准》化学药品地方标准第二册中有收载，也未进行有关物质检查。作为儿童药品，为了更好地控制本产品质量，提高进口注册标准，保证产品的疗效，本文采用高效液相色谱法［1-4］对阿莫西林颗粒剂中阿莫西林的含量及有关物质进行研究，建立了快速、准确、重现性好的含量测定方法及专属、灵敏的有关物质检查方法，可更好用于本品的质量控制。

　　1 仪器与试药

　　agilent1100高效液相色谱仪，agilent1200高效液相色谱仪，sartorius bp211d万分之一 电子 天平。

　　阿莫西林对照品（ 中国 药品生物制品检定所，批号为130409200609，纯度为86.6%，供含量测定用），阿莫西林颗粒剂（香港联邦制药厂有限公司，批号为17345、17374、17146、17155，规格：0.125 g/包），乙腈（色谱纯），磷酸二氢钾、氢氧化钾、氢氧化钠（分析纯），水为超纯水。

　　2 方法与结果 　　

2.1 检测波长的选择

　　取样品适量，加流动相溶解并稀释，在波长200～300 nm之间进行紫外扫描，结果阿莫西林在230 nm波长处有最大吸收，同时杂质在230 nm也有较大响应。因此选择230 nm为本法的检测波长。

　　2.2 含量测定

　　2.2.1 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，0.05 mol/l磷酸二氢钾溶液（用2 mol/l的氢氧化钾调节ph值至5.0）乙腈（体积比97.5∶2. 5）为流动相，流速为1.0 ml·min-1，检测波长为230 nm，柱温30 ℃，进样量20 μl。色谱结果见图1。

　　a.对照品;b.样品

　　图1 阿莫西林颗粒剂含量测定的hplc色谱图（略）

　　figure 1 hplc of amoxicillin

　　2.2.2 溶液的制备 对照品溶液：精密称取阿莫西林对照品适量，加流动相制成每1 ml含0.5 mg的溶液，即得。

　　供试品溶液：取装量差异项下的内容物，研细，精密称取粉末适量，加流动相溶解并定量稀释成每1 ml含0.5 mg的溶液，滤过，取续滤液，即得。

　　2.2.3 专属性试验 取空白辅料按“2.2.2”项方法制备溶液，进样测定。结果表明空白辅料对样品测定无干扰。将供试品在60 ℃温度下放置10 d，于第10天取样，按“2.2.2”项方法制备溶液，进样测定。结果表明本品经高温加速实验后，杂质总数和总量均有所增加，主成分与各种分解产物完全分离。将供试品在相对湿度92. 5%（kno3饱和溶液），温度35 ℃下放置10 d，于第10天取样，按“2.2.2”项方法制备溶液，进样测定。结果表明本品经高湿加速实验后，杂质总数和总量均有所增加，主成分与各种分解产物完全分离。色谱图见图2。

　　a.空白辅料;b.高温降解;c.高湿降解;1.阿莫西林

　　图2 阿莫西林专属性试验hplc色谱图（略）

　　figure 2 hplc of amoxicillin for selectivity test

　　2.2.4 线性关系考察 精密称取阿莫西林对照品适量，用流动相溶解并稀释成含阿莫西林0.099 47、0.198 9、0.397 9、0.497 3、0.596 8、0.795 8、0.994 7 mg/ml的溶液，按“ 2.2.1”项下的色谱条件进行测定，以质量浓度（ρ）为横坐标，峰面积（a）为纵坐标，得线性回归方程为a=29328ρ-6.7868，r=0. 999 9（n=7）。结果表明，阿莫西林质量浓度在0.1～1 mg/ml范围内与峰面积线性关系良好。

　　2.2.5 精密度试验 取同一批供试品（批号17374）1份，按“ 2.2.1”项下的色谱条件连续进样5次，其峰面积的平均值为16025.6，rsd为0.04%（n=5），表明方法精密度良好。

　　2.2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液分别于配制后0～8 h内按“ 2.2.1”项下的色谱条件进行测定，记录峰面积，结果阿莫西林的峰面积rsd为0. 1%，表明溶液在8 h内稳定。

　　2.2.7 重复性试验 取同一批样品（批号17374）6份，分别按“2.2.2”项方法制备溶液，进样测定， 计算 得阿莫西林的平均含量为104.1%，rsd为0.6%（n=6），表明分析方法重复性良好。

　　2.2.8 回收率试验 称取空白辅料，分成9等份，3份为１组，分别精密加入一定量的阿莫西林对照品，充分混合均匀，置50 ml量瓶中，按“2.2.2”项方法制备溶液，进样测定，计算回收率。结果阿莫西林平均回收率为100.0%，rsd=0.2%，表明本方法准确可靠。

　　2.2.9 检测限 在“2.2.1”项的色谱条件下，当阿莫西林对照品进样浓度为0.05 μg/ml时，记录的色谱峰峰高约为基线噪音3倍，根据进样量20 μl计算，阿莫西林的检测限为1 ng。

　　2.3 有关物质

　　2.3.1 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；0.05 mol/l磷酸二氢钾溶液（用2 mol/l的氢氧化钾调节ph值至5.0）乙腈（体积比99∶1）为流动相a，0.05 mol/l磷酸二氢钾溶液（ph 5.0）乙腈（体积比80∶20）流动相b，先以流动相a流动相b(体积比92∶8)等度洗脱，待阿莫西林峰洗脱完毕后按以下程序进行线性洗脱（见表1）,流速为1.0 ml/min；检测波长 230 nm；柱温30 ℃；进样量20 μl。色谱分离结果见图3。

　　表1 线性梯度洗脱（略）

　　table 1 gradient elution

　　2.3.2 溶液的制备 对照品溶液：精密称取阿莫西林对照品，加流动相a制成每1 ml含20 μg的溶液，即得。
　
　　供试品溶液：取装量差异项下的内容物，研细，精密称取粉末适量，加流动相a溶解并稀释成每1 ml含2 mg的溶液，滤过，取续滤液，即得。

　　a.对照品;b.样品;c.空白辅料;1.阿莫西林

　　图3 阿莫西林颗粒剂有关物质测定的hplc色谱图（略）

　　figure 3 hplc of amoxicillin and impurities
　
　　2.3.3 专属性试验

　　将供试品在60 ℃温度下放置10 d，于第10天取样，按“2.3.2”项方法制备溶液，进样测定。结果表明本品经高温加速实验后，杂质总数和总量均明显增加，主成分与各种分解产物完全分离。将供试品在相对湿度92.5%（kno3饱和溶液），温度35 ℃下放置10 d，于第10天取样，按“2.3.2”项方法制备溶液，进样测定。结果表明本品经高湿加速实验后，杂质总数和总量均有所增加，主成分与各种分解产物完全分离。色谱图见图4。

　　a.高温降解;b.高湿降解;1 阿莫西林

　　图4 阿莫西林专属性试验hplc色谱图（略）

　　figure 4 hplc of amoxicillin for selectivity test

　　2.3.4 线性关系考察 精密称取阿莫西林对照品适量，用流动相溶解并稀释成含阿莫西林0.049 7、0.024 8、0.012 4、0.006 2、0.001 2 mg/ml的溶液，按“2.3.1”项下的色谱条件进行测定，以质量浓度（ρ）为横坐标，峰面积（a）为纵坐标，得线性回归方程为a=29328ρ-6.6772，r=0.999 8（n=5）。结果表明，阿莫西林质量浓度在0.049～0.001 2 mg/ml范围内与峰面积线性关系良好。

　　2.3.5 重复性试验 取同一批样品（批号17374）6份，按“2.3.2”项方法制备溶液，进样测定， 计算 得单个最大杂质含量为0.53%，rsd为2.1%，总杂质含量为1.2％，rsd为2.0%（n=6），表明分析方法重复性良好。

　　2.3.6 检测限 在“2.3.1”项的色谱条件下，当阿莫西林对照品进样质量浓度为0.1 μg/ml时，记录的色谱峰峰高约为基线噪音3倍，根据进样量20 μl计算，得阿莫西林的检测限为2 ng。

　　2.4 样品测定

　　按拟定的方法测定4批样品中阿莫西林的含量，结果见表2。

　　表2 含量与有关物质测定结果 （略）

　　table 2 contents and related substance of amoxicillin

　　3 讨论

　　3.1 取3批样品同时采用原标准的uv法和本文的hplc法进行含量测定，结果见表3。结果表明hplc法测得的含量均小于uv法，可能是因为hplc法选择性好，能将阿莫西林与相似结构杂质分离，因此表明采用hplc法可更专属、快速地测定阿莫西林颗粒剂中阿莫西林的含量。

　　表3 2种含量测定方法的比较（略）

　　table 3 contents of amoxicillin by two methods

　　3.2 分别对刚生产及存放1年后产品进行有关物质考察比较，结果单个最大杂质含量由0.23％增加为0.53％，总杂质含量由0.44％增加为1.14％，说明对阿莫西林颗粒有关物质的检查是非常必要的。

　　3.3 分别选用色谱柱thermo ods c18 （200 mm×4.6 mm，5 μm）、tigerkin c18（200 mm×4.6 mm，5 μm）、shimadzu ods c18 （250 mm×4.6 mm，5 μm），取同一批样品分别进行试验，结果3种色谱柱理论塔板数均达到2 000以上，主峰与各杂质的分离度均符合要求，测定结果重现性好。

　　3.4 本文建立了专属、灵敏、快速、准确的阿莫西林颗粒剂的含量测定及有关物质检查的方法，可以更好的控制该药品的质量。本文结果提示这种主要用于儿童的药品，对其进行有关物质检查十分必要。

【 参考 文献 】
　　［1］ 国家药典委员会．中华人民共和国药典：2005年版二部［s］．北京:化学 工业 出版社，2005：296.

　　［2］ 李玮．hplc 法测定阿莫西林颗粒含量［j］．安徽医药，2002，6（1）：60-61.

　　［3］ 李彦威，勾洪磊，杨秀花,等.反相高效液相色谱法测定阿莫西林［j］. 理化检验：化学分册,2008,44（3）：216-217.

　　［4］ 樊生华,马月英,刘晋清,等.hplc法测定阿莫西林胶囊含量的探讨［j］.山西医科大学学报,2006,37(3)：268-270.