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突变人CD59分子抗MAC沉积在糖尿病血管病中的作用

发布时间:2015-07-03 12:28

【摘要】 目的: 研究糖化人突变(hm)cd59作为补体攻膜复合体(mac)抑制物在糖尿病血管病病理机制中的重要作用。方法: 构建2种hmcd59重组质粒, 转染cho细胞; fcm、 western blot筛选高表达细胞。糖化, bcecf释放试验测定糖化hm cd59和糖化hn cd59抗补体活性。elisa测定30例糖尿病无血管病变组和30例ⅱ型糖尿病血管病组血清pdgfbb、 vegf含量。结果: 筛选细胞株表达率分别为59.8%、 53.7%、 54.5%; bcecf释放试验显示糖化前转染突变cd59细胞比较糖化后细胞染料释放率低(p<0.01); 而正常cd59细胞比较糖化后细胞染料释放率无统计学意义。 ⅱ型糖尿病有血管病变组与糖尿病无血管病变组相比, 血清pdgfbb、 vegf明显增高(p<0.01)。结论: 证实hmcd59易糖化抗补体活性下降加速糖尿病血管病的发生发展。

【关键词】 cd59; 真核表达; 糖化; 补体; 免疫分子

function of human mutant cd59 molecule on diabetic vascular complication

  zhang li, gao meihua*

  department of immunology, medical college of qingdao university, qingdao 266000, china

  [abstract] aim: to investigate the function of human mutant cd59 in diabetic pathology. methods: the recombinant paltermax plasmid containing human mutant cd59 cdna and pcdna plasmid were cotransfected into cho cells using cation lipoid mediating method. highly expressed cells were selected by flow cytometry and western blot, which were then cultivated in high glucose. the functions of restricting complement membrane attack complex formation of glycated hmcd59 and hncd59 were detected by bcecf release test. elisa was used to detect the serum concentration of pdgfbb and vegf in 30 patients of typeⅱdiabetes without vascular proliferate complication and 30 typeⅱdiabetes patients with vascular proliferate complication. results: the expression rate of hm1cd59, hm2cd59, hncd59 cells was 53.7%, 54.5% and 59.8%, respectively. bcecf release test indicated the release rate of glycated hmcd59 cells was higher than that of unglycated ones (p<0.01)while no significant differences were found between normal hncd59 cells and glycated ones. the serum concentration of pdgfbb and vegf in patients with typeⅱdiabetes markedly increased (p<0.01). conclusion: the decrease of glycated restricting complement membrane attack complex results in the accelerating of human vascular proliferate complication of diabetes.

  [keyword]cd59; eukaryotic expression; glycation; complement; immunological molecule

补体调节蛋白cd59通过干扰补体攻膜复合体(membrane attack complex, mac)的形成, 保护宿主细胞免受补体的攻击。已有报道, mac刺激内皮细胞释放成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bfgf)及血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor, pdgf), 这两种因子可刺激成纤维细胞、 平滑肌细胞、 肾小球基底膜细胞和血管内皮细胞大量增殖[1], 最终导致糖尿病血管病。mac在糖尿病血管壁的增长性沉积已有文献报道。糖化被认为是糖尿病组织损伤的主要病理机制[2]。如果被糖化的蛋白质单氨基靠近活性位点就会影响蛋白质的功能。通过观察糖化蛋白的三维结构得以证实, 糖化易发生于靠近咪唑基的氨基或赖赖氨基的一部分。人类cd59nmr[3, 4]结构揭示了蛋白质赖氨酸k41是糖化位点, 它距离惟一含有咪唑基的组氨酸h44大约 5 。而且, k41邻近cd59功能基团w40[5]。这表明k41位点易于糖化使cd59失去活性。根据人类cd59分子的结构, 人们发现在高血糖环境下, 在cd59易于糖基化的位点k41h44上确实存在基因突变, 即hmcd59: k38 c39 w40 k41 h42 e43 q44 c45 n46 f47(正常hcd59: k38 c39 w40 k41 f42 e43 h44 c45 n46 f47), 在糖尿病患者的尿液中已经提取出了此hmcd59, 经测序得到证实。

  基于此, 本课题设计两种突变cd59cdna序列连接于palter质粒转染cho细胞, 筛选高表达细胞株, 通过bcecf释放试验证实了糖化人突变cd59在糖尿病血管并发症病理机制中的重要作用。应用酶联免疫吸附实验法测定ⅱ型糖尿病患者血清血小板衍生生长因子bb(pdgfbb)、 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, vegf)含量, 探讨这些免疫分子与糖尿病血管病变发生发展之间的相关性。

  1 材料和方法

  1.1 材料 cho细胞株购自中科院上海细胞生物学研究所, 大肠杆菌dh5α由本室保存。paltermax、 pcdna3由美国哈佛大学惠赠; 2’, 7’二羧乙基5 6羧基荧光素(bcecf)为sigma产品; 彩色蛋白质marker为gibco产品。lipfectamine 2000购自invitrogentmlife technologies 。pdgfbb、 vegf试剂盒由美国r&d systems公司提供。ⅱ型糖尿病无血管病变组30例, ⅱ型糖尿病有血管病变组30例, 均符合1997年美国糖尿病学会(ada)诊断标准。

  1.2 方法

  1.2.1 目的基因的选择及引物设计 (1)目的基因的选择: 1号人突变cd59(hm1) 42位(f)氨基酸突变为组氨酸(h)相应密码子cat(h)取代ttt, 即x37 x38 c39 w40 k41 h42 x43 x44 c45 x46; 2号人突变cd59(hm2)43位(e)氨基酸突变为组氨酸(h)相应密码子cat(h)取代gag, 即x37 x38 c39 w40 k41 x42 x43 h44 c45 x46。(2)引物设计: 根据已公布正常人cd59基因及已构建cd59cdna重组载体序列设计2对突变cd59基因引物序列, 1对常规上下游引物(pt7, t3)根据待插入cd59cdna模板两侧pt7、 t3 rna聚合酶启动子序列设计。每种突变基因再合成一对带有诱变位点的互补寡核苷酸引物(18f, 18r), 2对突变引物长度均为28碱基, 错配碱基位于中央。引物序列如下: 常规引物pt7为5′taa tac gac tca cta tag gc3′; 常规引物t3为5′att aac cct cac taa agg ga3′; hm1/f为5′aag tgt tgg aag cat gag cag tgc aat t3′; hm1/r为5′att gca ctg ctc atg ctt cca aca ctt g3′; hm2/f为5′g tgt tgg aag ttt cat cag tgc aat ttc3′; hm2/r为 5′gaa att gca ctg atg aaa ctt cca aca c3′。

  1.2.2 重组pcr定点突变获取目的突变基因 ecor i单酶切, t4连接酶连接, 构建paltermax突变cd59重组质粒, paltermax结构图(图1), pcdna结构图均含有氨苄青霉素抗性基因pcdna 含g418抗性基因。

  图1 paltermax结构图

  fig 1 construction of paltermax1.2.3 人基因突变cd59重组质粒(paltercd59)的扩增及鉴定 paltercd59质粒转化大肠杆菌dh5ɑ: 感受态细菌的制备; paltercd59质粒转化大肠杆菌dh5ɑ; 阳性菌落的筛选; 碱裂解法小提取paltercd59质粒。paltercd59质粒的酶切鉴定: 以ecorⅰ对碱裂解法获取的重组质粒dna进行37℃过夜单酶切, 注意标记好管号, 同时设空palter质粒阴性对照, 酶切产物进行12 g/l的琼脂糖凝胶电泳, 每孔加样品10 μl, 以及dna标准分子量参照, 观察结果, 筛选含重组基因的转化子。重组子的序列分析鉴定: dna自动序列测定仪测定并筛选出插入序列正确的细菌克隆, 命名为palterhm1cd59和palterhm2cd59。扩增提取质粒备用(1号2号重组质粒方法相同)。

  1.2.4 hmcd59、 hncd59转染cho细胞 应用f12培养基作转染及克隆筛选培养液、 1640作细胞扩增培养液(含青霉素100 g/l、 链霉素100 g/l及100 ml/l新生牛血清)。阳离子脂质体法介导pcdna与paltercd59质粒共转染cho细胞: 转染前1 d, 消化并按1×106细胞/孔的数量接种于24孔板中37℃、 co2孵箱培养24 h, 细胞达到80%~90%汇合; 稀释1 μl paltecd59重组质粒于100 μl血清培养基的转染管中, 混匀; 稀释1 μl脂质体于100 μl无血清培养基的转染管中, 混匀, 室温放置5 min; 混合稀释的质粒和脂质体, 室温放置20~30 min; 无血清无双抗培养液洗细胞1次; 将质粒和脂质体混合液加入细胞中, 轻混; 37℃、 co2孵箱培养4~6 h; 加入1 ml含200 ml/l fbs无双抗的培养液培养24 h; 2.5 g/l胰酶消化2~3 min, 每孔分别取20 μl、 200 μl、 1.5 ml于3个10 ml完全培养液的大板中培养。g418(400~800) mg/l筛选阳性克隆。

  1.2.5 hmcd59在cho细胞中表达的检测 (1)流式细胞术检测并筛选高表达克隆: 2.5 g/l胰酶消化paltercd59转染cho细胞成单细胞悬液, 细胞计数获取1×106个细胞, pbs洗3次, 1 500 r/min离心5 min, 加入fitc鼠抗人cd59单克隆抗体20 μl, 室温避光孵育30 min, pbs洗3次, 100目铜网过滤, 上机待测。同时设置pcdna空质粒转染的cho细胞阴性对照, 实验组及对照组均设定fitcigg2a同型对照。(2)western blot: 1×106个细胞加入200 μl细胞裂解液, 冰上2 h, 台式低温高速离心机12 000 g离心2 min去除细胞骨架, 上清入一新的ep管中, sdspage电泳; 蛋白质的凝胶电转印; 洗涤, 阴干1 h; 蛋白印迹试验: 封闭; 将膜转入1∶250稀释的羊抗人cd59抗体, 37℃恒温摇床反应1 h; 洗涤; 将滤膜加入1∶5 000稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗羊igg, 37℃恒温摇床反应1 h; 洗涤; dab显色; 去离子水漂洗终止反应。

  1.2.6 糖化人基因突变cd59功能的检测 接种2×104个细胞/孔200 μl于96孔板中, co2孵箱培养72 h以上, 每个补体浓度设6个复孔, 加设糖化组对照(培养液中含50 mmol/l核糖); 每孔加入nabh2cn调节浓度为20 mmol/l, co2孵箱培养20 min, 以维持细胞形态。

  1.2.7 免疫分子检测 (1)标本采集: 所有受检者抽取清晨空腹肘静脉血3 ml, edta抗凝, 3 000 r/min离心30 min, 15 min, 分离血清, -20℃保存备用。(2)测定方法: 采用elisa双抗体夹心法测定糖尿病血管组和糖尿病非血管病组患者pdgfbb、 vegf血清浓度。

  1.2.8 统计学分析 结果采用x±s表示, 利用spss11.0统计软件分析, 以p<0.05差异为有统计学意义。

  2 结果

  2.1 hncd59和hmcd59重组质粒酶切鉴定结果 paltermax空质粒载体为5 533 bp, 插入基因片段为495 bp, 重组paltermax突变cd59基因长约6 000 bp, 琼脂糖凝胶电泳结果显示, 比较dl 2 000 dna marker参照物, ecorⅰ酶切重组质粒得到约495 bp酶切产物, 其产物大小的片段与预期一致(图2)。测序结果进一步证实重组质粒插入片段与目的基因序列吻合。

  2.2 阳性细胞的筛选和检测 (1)g418筛选出正常和人突变cd59阳性表达克隆并扩增; (2)流式细胞术筛选出高表达细胞株hm1cd59表达率为53.7%, hm1cd59表达率为54.5%, hncd59表达率59.8%; (3)western blot检测阳性细胞克隆与阴性cho细胞裂解蛋白相比, 在mr约20 000位置出现1条较明显显色区带(图3), 即为cd59蛋白。

  2.3 糖化人基因突变cd59功能的检测结果 不同补体稀释度hm1 hm2 hn糖化前后染料释放率比较结果显示(图4)hm1 hm2糖化后较糖化前染料释放率明显增加; 而hn糖化前后染料释放率无明显变化。

  2.4 elisa结果 应用elisa方法检测ⅱ型糖尿病合并血管病变组与糖尿病无血管病变组血清vegf浓度比较, 差别有统计学意义(p<0.05); ⅱ型糖尿病合并血管病变组与糖尿病无血管病变组血清pdgfbb浓度比较(p<0.01), 差别有统计学意义。证明pdgfbb、 vegf参与了糖尿病血管病变的发生和发展。

  3 讨论

  本课题组成功构建了人基因突变cd59的真核细胞表达系统, 转染真核细胞, 获得高表达人突变cd59 cho细胞株。由于 h和k之间距离不同, 使得cd59对糖基化的敏感性不同, 与将cd59 分子37或38位氨基酸突变为组氨酸(h)相比, 突变41或42位氨基酸为组氨酸(h)对cd59分子抗补体活性的影响无明显差异, 表明h和k之间距离在一定范围内, cd59对糖基化的敏感性不明显。验证了观点: 糖化易发生于靠近咪唑基的氨基或赖赖氨基的一部分。大约靠近咪唑基5的氨基最易于被糖化。突变和正常cd59分子糖基化前后活性测定采用bcecf染料释放试验。非离子型的bcecf具有高的共轭度和荧光效率, 能迅速透过细胞膜进入细胞内, 随后被细胞内的非特异性酯酶水解为有活性的离子型bcec, 后者不能透过细胞膜留在细胞内。bcecf与cho细胞孵育进入细胞内, cho细胞和抗cho细胞多克隆抗体反应, 加入新鲜分离的人血清补体后, 补体被激活生成mac, 沉积到cho细胞膜, 诱导细胞膜通透性增高, 染料释放至细胞外。功能性cd59可抑制mac的形成, 功能越高, 保护作用越强, 因此可通过染料释放率=上清液荧光强度/(上清液荧光强度+细胞内荧光强度)反应cd59活性, 释放率越高, 活性越低, 反之, 释放率越低, 活性越高。突变cd59分子糖基化过程, 因cho细胞不能在高浓度葡萄糖中保持活性, 短时间糖基化又不能形成足够稳定的酮胺结合的碳水化合物, 故在试验中用糖基化速度较快的核糖与细胞共同培养使其糖基化。为稳定醛胺加合物及避免细胞体积和膜电压的改变(影响细胞对mac诱导的细胞溶解的敏感性的两个因素), 用nabh3cn处理。糖化后染料释放实验结果验证了人基因突变cd59比较正常cd59糖化后更易失去抗补体活性。应用酶联免疫吸附实验双抗体夹心法测定了糖尿病患者血清pdgfbb、 vegf的含量, 结果pdgfbb和vegf糖尿病有血管病变组较糖尿病无血管病变组升高。通过分析, 我们认为pdgfbb、 vegf参与了糖尿病血管病变的发生和发展, 其可能机制是: 长期高血糖使补体调节蛋白cd59被糖化, 其抑制c5b9形成功能受损, sc5b9生成增多。sc5b9与内皮细胞和平滑肌细胞结合致使内皮细胞和平滑肌细胞损伤活化, 内皮细胞和平滑肌细胞释放刺激性免疫分子, 主要为pdgfbb和vegf。另外, pdgfbb对vegf的表达具有正调节作用。血清中高浓度的pdgfbb和vegf通过和内皮细胞、 平滑肌细胞上相应受体结合, 促使平滑肌细胞、 单核巨噬细胞、 内皮细胞增生和内膜下迁移, 同时产生和分泌多种生长因子, 再通过自分泌和旁分泌作用, 进一步促进这些细胞增殖; 最终导致糖尿病血管病变的发生和发展。为糖尿病血管并发症的发生发展提供新的分子机制。

【参考文献】
  [1] 辛 颖, 娄能俊, 邢海燕, 等. 血管内皮生长因子、 转化生长因子在糖尿病肾病的改变及治疗后的变化[j]. 细胞与分子免疫学杂志, 2008, 24(4): 380-381.

  [2] 姜军作, 衣运玲, 刘志诚. 糖尿病微血管病变的研究进展[j]. 医学综述, 2004, 10(1): 52-53.

  [3] bodian dl, davis sj, morgan bp, et al. mutational analysis of the active site and antibody epitopes of the complementinhibitory glycoprotein cd59[j]. j exp med, 1997, 185(3): 507-516.

  [4] yu j, abagyan r, dong s, et al. mapping the active site of cd59[j]. j exp med, 1997, 185(4): 745-753.

  [5] zhu x, gao m, ren s, et al. activity after sitedirected mutagenesis of cd59 on complementmediated cytolysis[j]. cell molecular immunol, 2008, 5(2): 141-146.

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