锌和维生素A对乙醇致大鼠睾丸损伤的保护作用

【关键词】 乙醇;睾丸损伤;大鼠;锌;维生素a

【摘要】 目的 研究锌和维生素a(va)对长期摄入乙醇致大鼠睾丸损害的保护作用及可能机制。方法 40只健康雄性成年sd大鼠随机分为对照组、乙醇组、乙醇+葡萄糖酸锌组、乙醇+va组，每组10只，4组每日分别灌胃给予乙醇0、7.5 g/kg、乙醇7.5 g/kg+葡萄糖酸锌7.7 mg/kg、乙醇7.5 g/kg+va 50 μg/kg，连续13周。对4组大鼠的精子计数、精子活动率、精子畸形率、血清睾酮(t)、黄体生成素(lh)、卵泡刺激素(fsh)含量进行检测，光、电镜观察睾丸的形态改变。同时测定睾丸线粒体中丙二醛(mda)的产生量，免疫组织化学法检测睾丸组织中inos的表达。结果 与对照组相比，乙醇组大鼠精子计数减少，精子活动率下降，精子畸形率升高(p<0.05)，血清t、lh、fsh水平明显降低(p<0.05);睾丸生精上皮结构破坏，支持细胞和各级生精细胞均有退化变性;睾丸生精细胞inos表达明显增强(p<0.05);睾丸线粒体丙二醛含量明显升高(p<0.05)。与乙醇组相比，乙醇+葡萄糖酸锌组和乙醇+va组精子计数、精子活动率有所上升，生精细胞退化变性程度减轻，睾丸生精细胞inos表达减弱(p<0.05)，睾丸线粒体mda减少，但血清t、lh、fsh水平仍低于对照组(p<0.05)。www.lw881.com结论 补充锌和va可以限制乙醇引起的睾丸过氧化损伤，保护睾丸的生精功能，但仍有生殖内分泌激素合成障碍。

【关键词】 乙醇;睾丸损伤;大鼠;锌;维生素a

　protective effect of zinc and vitamin a on testis injury of rats induced by chronic alcohol intake xie lijun*, zhao song,hao na*,et al. * hebei center for disease prevention and control, shijiazhuang 050021,china

　　【abstract】 objective to investigate the protective effect of zinc and vitamin a on testis injury of rats induced by chronic alcohol intake and its possible s 40 healthy spraguedawley adult male rats were randomly divided into 4 groups: control group, alcohol group(7.5g/kg), alcohol+zinc group(alcohol 7.5g/kg+zinc gluconate 7.7mg/kg),and alcohol+vitamin a group(alcohol 7.5g/kg+vitamin a 50μg/kg).the alcohol,zinc gluconate and vitamin a were administrated to the rats for 13 weeks by a gastric tube. the sperm counting,motility and the percentage of abnormal sperm were serum sexual hormones (t, lh, fsh) were determined. the pathological changes of testicle tissue of rats were observed by light and electron microscopy. the malonaldehyde (mda) contents in testicular mitochondria were simultaneously determined. the expression of inos in testes was detected by immunohistochemistry. results as compared with control group, the sperm counting and motility in alcohol group were significantly decreased (p<0.05). the frequency of abnormal sperm was obviously increased (p<0.05).the serum levels of t, lh, fsh were significantly decreased (p<0.05). the mda content and the expression of inos were markedly higher than those of control group(p<0.05). histological evaluation for testes revealed that seminiferous epithelium was disorganized and the sertoli cells and germ cells were degenerated in alcohol-treated rats. zinc or vitamin a supplementation decreased the testicular mitochondrial mda formation and the expression of inos in testes, as a result,the germ cells degeneration was improved, sperm counting and motility were higher than those in alcohol group,however,which couldn’t prevent the decrease of serum levels of sexual hormones (t, lh, fsh)(p<0.05) .conclusion zinc or vitamin a supplementation limites the testicular peroxidation injury, which is a result of chronic alcohol exposure. to a certain degree zinc or vitamin a supplementation can protect the spermatogenesis function.

　　【key words】 alcohol; testis injury; rats; zinc; vitamin a

　　乙醇是一种确认致畸物，母亲孕期大量饮酒可致“胎儿乙醇综合征”[1]，男性酗酒可使性功能减退并引起后代发育和行为异常[2]。为提高人类生命质量和优生优育，研究乙醇的生殖遗传毒性具深远意义。本研究通过经口灌胃给予雄性大鼠乙醇，建立慢性乙醇中毒模型，观察乙醇对睾丸形态和功能的影响，及锌和维生素a(va)对其睾丸毒性的拮抗作用，并研究其可能的机制，为防止乙醇中毒及其所致的生殖毒性探讨有效的阻断途径。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组 选择健康性成熟雄性sd大鼠40只(河北省实验动物中心提供)，体重180～220 g。随机分为对照组、乙醇7.5 g/kg组(乙醇组)、乙醇7.5 g/kg+葡萄糖酸锌7.7 mg/kg组(乙醇+葡萄酸锌组)和乙醇7.5 g/kg+va 50 μg/kg组(乙醇+va组)，每组10只。

　　1.2 实验方法 乙醇染毒用无水乙醇加入一定体积的蒸馏水稀释后灌胃，灌胃量为1.5 ml/100 g，对照组给予等量蒸馏水，1次/d，连续13周;葡萄糖酸锌给予方式：葡萄糖酸锌(石家庄神威药业有限公司提供)用蒸馏水溶解并稀释至所需浓度;va给予方式：维生素a醇(华美生物工程公司北京分公司提供)先用少量乙醇溶解，再用蒸馏水稀释至所需浓度;二者均于每日下午灌胃。于末次染毒24 h后用乙醚麻醉动物，眼眶采血后处死，取双侧睾丸，称重，一侧待做睾丸线粒体丙二醛(mda)含量测定，另一侧用于光、电镜的形态学观察及免疫组织化学染色;取一侧附睾尾及输精管至于凹玻片上，剔去脂肪组织，将输精管内精液挤出，剪碎附睾尾，加入1 ml精子营养液[3]，混匀即成精子悬液，留待进行精子计数、活动率、畸形率测定。

　　1.3 观察指标

　　1.3.1 精子计数、活动率、畸形率测定：取精子悬液，按红细胞计数法[4]进行精子计数。制备精子悬液涂片，高倍镜下观察200个精子中活动与不活动的精子数，计算其活动率;精子悬液涂片于甲醛钙混合液中固定15 min，0.5%伊红染色10 min，观察1 000个精子，记录畸形的精子数，计算畸形率。

　　1.3.2 睾丸形态学观察：常规制备he切片和超薄切片，分别于光学显微镜及透射电子显微镜下观察。

　　1.3.3 血清睾酮(t)、促黄体生成素(lh)、促卵泡刺激素(fsh)的测定：采用放射免疫法。由北京核仪器厂产f646a型微机单头放免仪进行测定。试剂盒由中国原子能科学院同位素研究所提供。

　　1.3.4 睾丸线粒体mda含量测定：取一侧睾丸，摘除被膜后，加入6倍体积含0.25 mmol/l蔗糖、1 mmol/l氯化镁、10 mmol/l trishcl的缓冲液(ph=7.4)，在冰浴下制成匀浆，使用日本产rp20型高速冷冻离心机在4℃条件下600 g/min离心得上清液，再以9 700 g/min离心30 min，沉淀用0.15 mmol/l氯化钾和0.15 mmol/l磷酸钾组成的缓冲液(ph=7.4)冲洗，再以同样速度离心30 min，最后得睾丸线粒体，mda的测定用南京建成生物研究所试剂盒，严格按操作说明书进行;考马斯亮蓝法测定蛋白含量。

　　1.3.5 免疫细胞化学染色：睾丸组织于4%的多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋、切片后以abc法进行免疫组织化学染色。一氧化氮合酶(inos)单克隆一抗、sp免疫组化试剂盒、3.3二氨基联胺(dab)试剂盒均购自北京中山生物技术公司。切片经1%甲醇过氧化氢处理30 min，封闭血清于37℃处理30 min，加入inos(1∶50)抗体于4℃冰箱过夜，再加入生物素标记的二抗，37℃处理30 min，加入辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素孵育30 min，经dab显色3～5 min，经pbs充分冲洗，经苏木素复染1～3 min，流水充分冲洗后干燥、脱水、透明、中性树胶封片，光镜观察。免疫组织化学图像分析经标准灰度校正后随机取5个视野，在同等条件下测定inos的平均积分光密度值(od)(平均总积分减去平均背景积分)。显微镜及其摄影系统均为olympus公司产品。免疫组化图像分析用武汉同济大学医学院病理教研室干屏公司的hpias1000型全自动图像分析系统。

　　1.4 统计学分析 应用spss 10.0统计软件，计量资料以±s表示，采用dunnet t检验，p<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 4组精子计数和活动率及畸形率比较 乙醇组与对照组相比，精子数减少(p<0.05)，精子活动率下降(p<0.05)。乙醇引起的精子形态改变有：头部畸形如无头、小头、巨头、双头等;尾部卷曲、无尾或双尾等，乙醇组精子畸形率与对照组相比明显升高(p<0.05)。乙醇+葡萄糖酸锌组精子计数、精子活动率较乙醇组明显上升(p<0.05)，但仍明显低于对照组(p<0.05);精子畸形率虽有所下降，但与乙醇组相比差异无统计学意义(p>0.05)。乙醇+va组精子计数、精子活动率较乙醇组明显上升(p<0.05)。见表1。表1 4组精子计数和活动率及畸形率比较注：与对照组比较，*p<0.05;与乙醇组比较，#p<0.05

　　2.2 睾丸的组织病理学观察 光镜下对照组睾丸生精上皮呈规则圆形，排列紧密，结构清晰，层次分明，精原细胞大而圆，规则地紧贴曲细精管的基底膜，向内依次为初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞、精子。乙醇组睾丸的曲细精管有不同程度的损伤，表现为某些生精细胞核固缩、变性，精子细胞变态期核固缩，曲细精管腔中脱落细胞增多。电镜观察睾丸的超微结构：对照组基膜平整，支持细胞腔凹窝内嵌着各级处于不同时期的生精细胞，有精原细胞、初级精母细胞和变态期精子细胞;乙醇组大鼠生精上皮超微结构显示，各级生精细胞和支持细胞均有损伤，包括：(1)支持细胞内溶酶体增多，支持细胞滑面内质网变性退化;(2)精原细胞核空泡化;(3)初级精母细胞核变性溶解;(4)精子细胞变态期核溶解，局部核内陷，核周隙扩大;(5)变态期精子细胞移至基膜处，示生精上皮紊乱。乙醇+葡萄糖酸锌组动物睾丸损伤程度明显轻于乙醇组，表现为受损的曲细精管较乙醇组少，退化变性的细胞数亦少。乙醇+va组大部分曲细精管结构正常，超微结构下精子细胞、精子顶体形成期均正常。

　　2.3 乙醇对血清t、lh、fsh的影响 乙醇组血清t、lh、fsh水平均较对照组明显降低(p<0.05);乙醇+葡萄糖酸锌组和乙醇+va组的血清t、lh、fsh水平仍明显低于对照组(p<0.05)，与单纯给予乙醇组比较差异无统计学意义(p>0.05)。见表2。

　　2.4 睾丸线粒体mda含量测定 乙醇组睾丸线粒体mda产生量明显高于对照组(p<0.05)，乙醇+葡萄糖酸锌组和乙醇+va组睾丸线粒体mda量明显低于乙醇组(p<0.05)，但仍较对照组高(p<0.05)。见表2。

　　2.5 睾丸组织中inos的表达 免疫组织化学染色显示，inos的阳性表达位于细胞浆，呈棕黄色。对照组大鼠生精细胞中的inos表达很弱，仅见于散在分布的少数降解的初级精母细胞。乙醇组大鼠睾丸各级生精细胞inos呈较强的阳性表达。经过对图像分析系统的数据进行统计分析，乙醇组大鼠生精细胞中inos表达平均灰度值明显高于对照组(p<0.05)，乙醇+葡萄糖酸锌组和乙醇+va组的睾丸inos表达平均灰度值较单纯给予乙醇组明显降低(p<0.05)，但仍较对照组升高(p<0.05)。见表2。表2 4组血清t mda及inos表达水平比较与对照组比较，*p<0.05;与乙醇组比较，﹟p<0.05

　　3 讨论

　　3.1 乙醇摄入引起睾丸的氧化损伤 本实验表明连续给予乙醇13周，大鼠精子数量减少、精子活动率下降、精子畸形增多;睾丸生精上皮结构破坏，支持细胞和各级生精细胞、精子均有退化变性;性激素t、lh、fsh分泌减少。说明乙醇一方面直接作用于睾丸，使生精细胞退化变性，影响精子的质量和数量，还可以抑制睾丸间质细胞合成睾酮，另一方面直接或间接作用于下丘脑-垂体轴，从而进一步影响睾丸的生殖功能。这与许多研究报道一致[5，6]。一氧化氮(no)是一种具有广泛生物学活性的信使分子，参与众多的生理和病理过程，在男性生殖系统功能的调节中具有重要作用。体内no主要是由no合酶(nos)催化左旋精氨酸产生。no合酶包括神经元型(nnos)、诱导型(inos)、内皮型(enos)。nnos和enos被认为是nos的生理存在形式，激活时释放少量no，它介导阴茎勃起，调节睾丸血供及激素分泌，参与精子发生、获能并影响精子质量。而inos在正常组织内表达较弱，仅在胞受到刺激时表达明显增强，产生大量no及超氧阴离子。过量no与超氧阴离子反应生成具更强氧化性的onoo-,作用于酶、蛋白质、脂质及dna等大分子物质，产生细胞毒作用，导致细胞损伤或死亡[7];而睾丸线粒体膜、精子均富含不饱和脂肪酸，易受过氧化攻击，从而严重影响睾丸生精功能及精子生活的内环境。生物组织中mda形成是多不饱和脂肪酸过氧化分解的结果，通过测定mda的含量可判定脂质过氧化程度。本研究显示乙醇组大鼠生精细胞inos表达增强，睾丸线粒体mda产生增多，同时睾丸发生明显的组织学改变，表现为生精细胞退化变性，生精上皮层变薄，生精细胞排列紊乱，有的甚至变性、坏死、脱落，提示过量no引起的氧化损伤可能是乙醇致睾丸损伤的重要机制之一。

　　3.2 锌和va对乙醇所致睾丸损伤的保护作用 锌是机体必需的微量元素，与生殖系统的发育、功能密切相关，睾丸组织对锌有强烈的依赖性，缺锌时睾丸内蛋白、脂质及核酸的氧化损伤增强，dna应变能力降低，正常精子染色体结构易遭到破坏。在适量锌存在，可抗自由基等多种因素诱发的睾丸生精细胞凋亡[8，9]。va不仅是一种抗氧化剂，也是精子发生所必需的。morales[10]研究表明大鼠缺乏va10周后，发生唯支持细胞综合征，而在补充va后精子发生又重新恢复。不仅如此，锌和va还与乙醇代谢关系密切，乙醇代谢需要关键酶——乙醇脱氢酶，锌是乙醇脱氢酶的辅因子;而va(视黄醇)在器官内转化为具有生物活性的视黄醛，亦需要乙醇脱氢酶的催化。因此乙醇可以通过竞争性抑制va代谢来阻碍va的活化，乙醇代谢又消耗锌，故长期摄入乙醇可使va和锌缺乏，进而导致生精上皮发育不良，精子发生受抑，这也可能是乙醇致睾丸损伤的作用机制之一。

　　本研究表明葡萄糖酸锌组和va组精子计数、精子活动率明显升高，曲细精管受损程度减轻，睾丸inos表达减弱，线粒体丙二醛产生减少,血清t、lh、fsh下降。说明给乙醇喂养动物补充锌和va限制了乙醇所致的睾丸的过氧化损伤，生精细胞退化变性程度减轻，在一定程度上保护了睾丸的生精功能，保持了生精细胞的成熟，但仍有生殖内分泌激素合成障碍。

　　由此可见，乙醇可使生精细胞退化变性，精子发生和睾酮合成受抑，还可致下丘脑-垂体轴生殖内分泌功能受损。过量no引起的氧化损伤可能是乙醇致睾丸损伤的重要机制之一。补充锌和va对乙醇所致睾丸损伤有一定的保护作用。

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