IL-21在慢性乙型肝炎中免疫调节作用的研究

【关键词】 白细胞介素21;肝炎,乙型,慢性;cd8+t细胞;免疫调节

【摘要】 目的探讨白细胞介素21(il-21)在慢性乙型肝炎中的免疫调节作用。方法采用酶联免疫吸附试验(elisa)检测32例慢性乙型肝炎病人(病人组)和29例健康人(对照组)血清中il-21水平。提取外周血单个核细胞后分别设为il-21刺激组、il-2刺激组和未刺激组，多色流式分析技术检测cd8+t细胞频率，胞内细胞因子染色技术检测cd8+ifn-γ+t细胞的频率。　　结果与对照组相比，病人组血清中il-21浓度明显增高(t=2.75，p<0.01);与il-2刺激组和未刺激组相比，il-21刺激组cd8+t细胞频率及分泌ifn-γ水平显著升高(f=59.27、10.27，q=3.82~14.11，p<0.01)。结论il-21通过对cd8+t细胞的免疫调节效应参与慢性乙型肝炎病人体内病毒的清除，为临床治疗提供了新的靶标。

【关键词】 白细胞介素21;肝炎,乙型,慢性;cd8+t细胞;免疫调节

　　[abstract]objectiveto investigate the role of il-21 in patients with chronic hepatitis b (chb).methodsserum il-21 in 32 patients with chb and 29 healthy subjects were determined using enzyme-linked immunosorbent assay (elisa). after extraction of peripheral blood mononuclear cell, a setting of il-21-stimulus, il-2-stimulus and not-yet stimulus group was made. hbv dna was analyzed with rt-pcr. the frequency of cd8+ t cells was analyzed by flow cytometry, and that of ifn-γ by intracellular cytokine scompared with the controls, the serum concentration of il-21 in chb was markedly higher (t=2.75,p<0.01); compared with il-2 stimulus and not-yet stimulus, the frequency of cd8+ t cells and secretion of cd8+ifn-γ+ t cells dramatically increased (f=59.27,10.27;q=3.82-14.11;p<0.01).conclusionil-21 involves in eli-mination of viruses in the body of patients with chb through immunological regulation of cd8+ t cells, which provides a new target for clinical therapy of the disease.

　　[key words]interleukin-21; hepatitis b, chronic; cd8+ t cells; immune regulation

　　我国是全球乙型肝炎病毒(hbv)感染高流行区，hbv携带者超过1亿人，现症慢性乙型肝炎病人约3 000万，每年新增病例50万～100万[1-2]。Www.lw881.com尽管预防性hbv疫苗已经在全球广泛应用，但慢性持续性hbv感染率仍居高不下，严重威胁着人类的健康。目前，由于尚不清楚hbv感染后乙型肝炎慢性化的确切机制，所以无法制定出行之有效的治疗方案。因此，明确该机制，可望为乙型肝炎的临床治疗提供新的线索和可靠的理论依据。白细胞介素21(il-21)是近年来发现的一种细胞因子，属于ⅰ型细胞因子家族，主要是由cd4+t细胞合成和分泌。人类的il-21基因定位于4q26-27,鼠类的il-21基因位于3号染色体[3]。最近研究证实，在淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)慢性感染中，il-21担负着重要作用，并与病毒的清除直接相关，这一重大发现为hbv慢性持续感染的研究带来了新的思路。本研究旨在探讨在慢性hbv感染过程中，il-21担负着怎样的作用?对乙型肝炎特异性cd8+t细胞是否存在免疫调控作用?

　　1对象与方法

　　1.1研究对象

　　慢性乙型肝炎病人32例(病人组),男20例，女12例;平均年龄(41.2±13.6)岁。病人均来自青岛市市立医院，诊断符合2000年全国第十次病毒性肝炎及肝病学术会议(西安)制定的标准，均排除合并肿瘤及自身免疫性疾病者。健康对照组29例，男18例，女11例;平均年龄(37.2±9.5)岁。

　　1.2主要试剂和仪器

　　美国bd公司产facs calibur型流式细胞仪。美国宝特公司产酶标仪。cd3-pe、cd8-fitc、ifn-γ-apc等均购自美国bd公司。hbv血清标志物elisa检测试剂盒由上海实业科华科技有限公司提供。il-21试剂盒购自美国tpi公司。

　　1.3il-21水平检测

　　采用双抗体夹心elisa方法检测受试者血清il-21水平。取受试者血清及标准液各50 μl加入酶标板，37 ℃孵育30 min;每孔加酶标抗体50 μl，37 ℃孵育30 min。洗涤5次加底物显色;终止反应后，采用酶标仪测定吸光度(a)值，以a值计算il-21水平。

　　1.4外周血单个核细胞(pbmc)的提取

　　将淋巴细胞分离液加入到10 ml尖底离心管中;用毛细吸管加入等量的倍比稀释血液，2 000 r/min离心25 min。使用毛细吸管轻轻吸取白膜层的pbmc，洗涤后使用含体积分数0.10胎牛血清的rpmi 1640培养液重悬细胞，培养于6孔板中备用。分为以下3组：il-21刺激组(加入20 μl的il-21)、il-2刺激组(加入20 μl的il-2)、未刺激组(不加il-21和il-2)。共孵育10 d后，检测cd8+t细胞的数量及功能。

　　1.5流式细胞分析技术检测cd8+t细胞频率

　　肝素抗凝的全血200 μl加2 ml pbs稀释后，1 000 r/min离心5 min;用吸管小心移弃上清液;分别加20 μl以pe标记的cd3、fitc标记的cd8抗体于全血细胞中，设置同型对照，混匀;室温避光孵育30 min;洗涤;加facs裂解液，室温10 min;待细胞悬液变成真性溶液后洗涤2次;以10 g/l多聚甲醛200 μl重悬固定，流式细胞仪检测cd8+t细胞频率，bd facs 专用facsdiva软件分析。

　　1.6特异性肽刺激活化胞内ifn-γ染色

　　3组孵育10 d后，分别加入20 μl以pe标记的cd3、fitc标记的cd8单克隆抗体及同型对照，室温避光孵育20 min;然后加入1× facstm穿透液500 μl，室温下避光孵育15 min;洗涤1次;分别加入20 μl荧光标记的ifn-γ抗体及同型对照，室温下避光孵育20 min;洗涤2次，重悬于10 g/l多聚甲醛溶液200 μl 中，上机检测。

　　1.7统计学处理

　　数据以±s表示，使用stata 7.0及ppms 1.5[4]统计软件进行统计学处理。多组间均数比较采用单因素方差分析,两组间均数比较采用t检验,p<0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1两组血清il-21浓度比较

　　对照组和慢性乙型肝炎病人组血清il-21浓度分别为(196.33±114.56)、(274.18±106.22)ng/l，与对照组相比，病人组血清il-21浓度明显增高(t=2.75，p<0.01)。

　　2.2cd8+t细胞频率

　　与未刺激组及il-2刺激组相比，il-21刺激组cd8+t细胞的频率明显增高，差异有显著性(f=59.27，q=11.39、14.11，p<0.05)。见表1。

　　2.3cd8+t细胞胞内ifn-γ的检测

　　与未刺激组及il-2刺激组相比，il-21刺激组cd8+ifn-γ+t细胞频率显著增高，差异有显著性(f=10.27，q=3.82、6.28，p<0.01)。见表1。表1各组cd8+t细胞和 cd8+ifn-γ+t细胞频率比较

　　3讨论

　　在hbv感染中，hbv作为嗜肝的dna病毒，本身对肝细胞并没有损害;而在清除胞内hbv和肝细胞的损伤中均起关键作用的是cd8+t细胞，即细胞毒性t细胞 (ctl)。在急性hbv感染中，可激发强烈的、多克隆的表位特异性ctl反应;而在慢性感染中，这些反应是微弱的甚至缺失的，造成ctl反应低下的原因仍有待于研究[5-6]。传统理论认为，cd4+t细胞通过分泌il-2，促进cd8+t细胞的增殖及免疫学效应。而在慢性乙型肝炎中，这种功能薄弱，于是有学者期望通过提高il-2的分泌，改善cd8+t细胞的功能，促进病毒的清除，以期达到治疗目的，但是临床效果甚微，说明尚未找到其真正的作用靶标。

　　近期研究结果提示，il-21在慢性感染中可发挥免疫调控效应。在lcmv慢性感染模型中，若敲除il-21基因可严重影响lcmv的清除[7-9]。这一重大发现为我们的研究带来新的思路。本研究结果显示，乙型肝炎病人血清中il-21含量增高，提示其在hbv感染中担负着一定的作用。为揭示il-21发挥免疫学效应的机制，本研究设置不同组观察其对cd8+t细胞数量的影响，结果显示，用il-21刺激后，cd8+t细胞数量显著增高，且超过il-2的刺激效应，说明cd4+t细胞可以通过分泌il-21而刺激病毒特异性cd8+t细胞的增殖，这一新发现是对传统概念的突破。

　　近年来研究结果提示，cd8+t细胞识别hbv感染肝细胞表面的靶抗原后，主要通过两种途径发挥免疫学效应。以往对hbv的清除机制主要倾向于cd8+t细胞对靶细胞的直接杀伤作用，即通过穿孔素和颗粒酶的释放等使病毒和感染细胞 “同归于尽”。近来越来越多的研究证据使这一传统学说受到挑战，目前认为ctl的非细胞损伤的病毒清除机制占优势地位。cd8+t细胞介导的细胞无损伤的病毒清除主要是通过细胞因子的释放，如ifn-γ和tnf-α等，达到清除病毒的目的[10-11]。为验证il-21在促进cd8+t细胞数量增高时是否会改善其功能，本研究利用流式细胞分析技术并胞内细胞因子染色技术观察了il-21对不同组cd8+t细胞胞内ifn-γ分泌情况的影响，结果显示，加入il-21刺激后，cd8+t细胞分泌ifn-γ功能增强。

　　综上所述，il-21在慢性乙型肝炎中担负着重要的免疫调节效应，其通过改善cd8+t细胞的数量及功能，帮助清除病毒。本研究结果为慢性乙型肝炎的治疗提供了新的思路。

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