病理性瘢痕组织中角朊细胞的免疫诱导作用

　　【关键词】 角朊细胞

　　关键词: 角朊细胞;增生性瘢痕;瘢痕疙瘩;粘附分子;免疫病理学

　　摘 要:目的 探讨增生性瘢痕(HS)和瘢痕疙瘩(Ks)，角朊细胞(KC)表达ICAM-1和HLA-DR)，及≤1mo的HS(HS1)，2～6mo的HS(HS2)和7～24mo的HS(HS3)标本，分别作抗ICAM-1，HLA-DR，CD3 ，CD4 和CD8 的McAb的SABC方法免疫组化染色和观察. 结果 各组KC表达I-CAM-1和HLA-DR抗原的阳性检出率(%)、CD3+ 细胞密度(cells/mm2 )及CD4+ /CD8+ 比值(x ±s)，并作统计学处理.各组标本的KC表达ICAM-1和HLA-DR抗原的阳性检出率依次为:Ks-I>Ks-P>Ks-A，HS1>HS2>HS3(t，P<0.05～0.001).各组KC表达ICAM-1和HLA-DR的阳性率与组织内浸润的CD3+ 细胞密度和CD 4+ /CD8+ 比值呈明显正相关(P<0.05～0.01，r=0.249～0.324). 结论 KS和HS的KC通过表达ICMA-1和HLA-DR抗原，诱导T细胞浸润，上调局部免疫炎性反应，可能是病理性瘢痕形成的重要因素.

　　Keywords:keratinocytes;hypertrophic scar;keloid;adhe-sion molecule;immunopathology

　　Abstract:AIM To investigate the relationship between T lymphocytes and the ICAM-1and HLA-DR antigen expressed by keratinocytes(KC)of hypertrophic scars and keloids.

　　METHODS Tissue samples were taken from different parts of keloids(Ks)ve part(Ks-1)，proliferative part(Ks-P)and aged part(Ks-A)，and hypertrophic scars(HS)of different stages， of≤1mo.(HS1)，HS of2～6mo.(HS2)and HS of7～24mo.(HS3).Immunohis-tochemical stains(SABC)were used to examine the positive rate of ICAM-1and HLA-DR antigen expressed by KC，the density of CD3+ T cell(cells/mm2 )and the ratio of CD4+ /CD8+ S The positive expression rate of I-CAM-1and HLA-DR antigen of KC in each group was as fol-lows:Ks-I>Ks-P>Ks-A，HS1>HS2>HS3(t，P<0.05～0.01).It showed obuious positive correlation with the densi-ty of CD3+ T cell and the ratio of CD4+ /CD8+ ┐CLUSION Keratinocytes of Ks and HS，by way of expres-sion of ICAM-1and MLA-DR antigens，could induce T cell infiltration and up-regulate the local immunologic inflamma-tory may be an important factor in the formation of Ks and HS.

　　0 引言

　　细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)又称CD54 抗原，是淋巴细胞功能相关抗原-1(lymphocyte function associated anti-gen-1，LFA-1或CD11a)的配体.二者结合是免疫活性细胞向表皮移行、介导细胞间相互作用的重要条件[1] .研究表明，多种皮肤病病损处的角朊细胞(ker-atinocytes，KC)可表达ICAM-1和HLA-DR抗原，正常皮肤表皮细胞不表达上述二种抗原[2，3] .近年研究表明，瘢痕疙瘩(keloids，Ks)和增生性瘢痕(hy-pertrophic scar，HS)与免疫介导有关.为探讨Ks与HS组织中表皮细胞(注:烧伤后HS的表皮细胞主要来自附件上皮细胞的修复)和附件上皮细胞(以下统称为KC)表达ICAM-1和HLA-DR抗原与浸润细胞的关系，我们采用连续冰冻切片和SABC技术，进行免疫组化染色和观察.

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 Ks标本13份分布于胸骨柄5份，面颈1份，肩背3份，耳垂部4份.手术切除的瘢痕块，按鲍卫汉等

　　[4] 方法，分成中央凹陷的老化部(Ks-A)9份，凸出明显的增生部(Ks-P)13份，与正常皮肤交界的浸润部(Ks-I)9份，年龄2～45岁，男4例，女9例，病程1～15a.37份HS标本年龄和分布与Ks相近，男20例，女17例，系深Ⅱ度烧伤愈合后1～24mo的HS标本，其中≤1mo的HS(HS1)10份，2～6mo的HS(HS2)12份，7～24mo的HS(HS3)15份，留相同部位正常皮肤(NS)10份为对照.所有标本均来自我院门诊和住院手术治疗的患者，每个标本分为2块，1块用40g L-1 多聚甲醛缓冲液(pH7.4)固定，石蜡包埋，常规病理观察，另1块OCT包埋后，于-40℃冰箱内冻存，所有标本均经临床和病理确诊，Ks主要诊断依据是侵袭性生长外观和有手术复发史.鼠抗HLA-DR(mAb，北京邦定生物医学公司)，鼠抗ICAM-1(CD54 )、CD3 (Leu4，总T细胞)、CD4 (Leu3a，Th/i)和CD8 (OKT8，Ts/c)mAb均购自Becton-Dickinson公司，工作浓度为1 50～100，SABC试剂盒购自武汉博士德公司.

　　1.2 方法 连续冰冻切片厚5μm，捞于APES包被的载玻片上，风干后参照试剂说明书作SABC免疫组化染色，常规以PBS和山羊血清代替第一抗体作阴性对照和淋巴结组织作阳性对照.KC及浸润细胞胞膜上见棕黄色物质为阳性.高倍镜(×400)下采用网格测微器(5/25)观察5个不同视野内的阳性细胞浸润数，以cells/mm2 表示阳性细胞密度.表达ICAM-1和HLA-DR抗原的KC常呈灶性或连续性网状分布，观察各组标本的阳性检出率(%).

　　统计学处理:①各组KC表达ICAM-1和HLA-DR抗原的阳性检出率，作χ2 分析;②各组CD3+ T细胞密度和CD4+ /CD8+ 比值作t检验;①与②之间作单因素相关分析和t检验.

　　2 结果

　　2.1 ICAM┐1和HLA┐DR抗原分布 正常皮肤:KC不表达ICAM-1抗原，但真皮内微血管内皮细胞(mVEC)可表达ICAM-1.正常皮肤的表皮细胞也不表达HLA-DR抗原，但表皮内呈树突状的郎格罕细胞HLA-DR抗原阳性，真皮内可见散在HLA-DR+ 浸润细胞，皮肤附件(毛囊、皮脂腺和汗腺)中汗腺上皮细胞HLA-DR抗原呈弱阳性.瘢痕组织:Ks-I(9/9;Fig1，2)，Ks-P(10/13)，Ks-A(1/9)，HS1(10/10)，HS2(9/12)，HS3(4/15)的瘢痕组织中KC分别表达ICAM-1和HLA-DR抗原.各组标本阳性检出率χ2 分析结果:Ks-I>Ks-P>Ks-A，HS1>HS2> HS3(P<0.05).在同一标本连续冰冻切片的相同部位呈一致的阳性结果，分布于表皮基底细胞和棘层细胞以及附件上皮细胞部位，周围组织中有大量淋巴细胞浸润，可见附件结构破坏.ICAM-1抗原多呈灶性分布，而HLA-DR抗原多呈连续网状分布.在被检的阳性标本中，瘢痕增生活跃部位mVEC表达I-CAM-1抗原明显增强，微血管周散在分布ICAM-1+ 和相当数量呈晕状分布的HLA-DR+ 浸润细胞.随Ks和HS病程的发展，瘢痕组织中附件结构和浸润细胞数量均逐渐减少.部分KC只表达HLA-DR抗原，而不表达ICAM-1抗原，但组织中多数mVEC和少数浸润细胞仍表达HLA-DR抗原，而不表达I-CAM-1抗原.

　　2.2 CD3+ ，CD4+ 和CD8+ 浸润细胞分布 正常皮肤和瘢痕组织内CD3+ T细胞平均值及其CD4+ /CD8+ 的比值分别为:NS(228±27)及(2.0±0.2) mm-2 ;Ks-I(730±144)及(2.7±0.4) mm-2 ;Ks-P(469±61)及(1.9±0.3) mm-2 ;Ks-A(164±28)及(1.1±0.3) mm-2 ;HS1(845±72)及(2.0±0.4) mm-2 ;HS2(507±85)及(1.7±0.3) mm-2 ;HS3(290±72)及(1.2±0.5) mm-2 .CD3+ 细胞密度和CD4+ /CD8+ 比值统计学t检验，Ks-I>Ks-P>Ks-A，HS1>HS2>HS3(P<0.01).上述阳性细胞主要集中在瘢痕组织浅层的微血管周围(Fig3)，在瘢痕增生期(HS1，HS2和Ks-I，Ks-P)的毛囊-皮脂腺和汗腺周围浸润细胞呈簇状分布(Fig4)，mVEC和Fb在此增生活跃.

　　各组标本KC表达ICAM-1抗原的阳性检出率与浸润的CD3+ 细胞密度和CD4+ /CD8+ 比值作单因素相关分析，r值分别为:0.324和0.249，经t检验P<0.01和P<0.05.

　　3 讨论

　　瘢痕增生受多种因素，如细胞、细胞外基质、细胞因子(包括单核细胞因子、细胞生长因子和炎性介质)、激素(性激素、生长激素)和免疫(细胞免疫和体液免疫)等调控.其中，免疫介导的细胞因子调节胶原代谢(合成>分解)失衡，是近年对病理性瘢痕形成机制的研究进展[5] .人类KC具有吞噬功能，在某些皮肤病的免疫应答中可能具有特别的抗原递呈作用[6，7] .在免疫应答中，淋巴细胞与相应(ICAM-1+ ，HLA-DR+ )抗原递呈细胞粘附，以诱导特异性体液和细胞免疫，使效应细胞杀伤靶细胞[8] .长期以来，人们习惯于对皮肤表皮细胞的研究，而忽略了与皮肤紧密相连而作为皮肤重要组成部分的皮肤附件上皮的研究，对病理性瘢痕组织中皮肤附件的作用，近年已开始引起重视[9] .我们观察到瘢痕疙瘩和增生性瘢痕的早期和中期，KC可表达ICAM-1或(和)HLA-DR抗原，随瘢痕成熟和老化(萎缩)，KC表达I-CAM-1或(和)HLA-DR抗原的阳性检出率、浸润的总T淋巴细胞数和激活的(HLA-DR + )T淋巴细胞数均逐渐减少.瘢痕组织的KC表达ICAM-1和HLA-DR抗原的阳性检出率与CD3+ 细胞密度的均值和CD4+ /CD8+ 比值之间呈正相关(P<0.05～0.01).瘢痕疙瘩和增生性瘢痕组织内CD3+ 细胞密度和CD4+ /CD 8+ 比值由高至低的变化过程与Castagnoli等[10] 结果一致，说明这些免疫活性细胞的存在与瘢痕增生密切相关.何春涤等[6] 在寻常银屑病等皮肤病组织中，未发现KC表达ICAM-1和HLA-DR抗原与浸润的T细胞之间有明显的相关性.这可能与这些皮肤病的发病机制、标本的选择和统计方法不同有关.KC表达ICAM-1或(和)HLA-DR抗原，可能与早期瘢痕组织内激活的T细胞和单核-巨噬细胞等释放的IFNr，IL-1α及TNF密切相关[3，6] .

　　图1 -图4　略

　　部分瘢痕标本组织内有较多T细胞浸润，但KC未见ICAM-1抗原表达，却可见HLA-DR抗原表达，提示:①诱导KC表达ICAM-1和HLA-DR抗原的机制可能不同，即CD4+ 细胞可分为二种功能不同的亚群[3] ，其中一种不能产生IFNγ和TNF，故难以诱导KC表达ICAM-1抗原;②KC对CD 4+ 细胞分泌的IFNr的反应不同，或组织切片未呈现阳性部位; ③体现KC对ICAM-1和HLA-DR抗原表达水平或先后次序，以及与浸润细胞之间相互作用的复杂关系.同上组织中，mVEC强表达ICAM-1抗原，可能是局部维持适量免疫活性细胞的基础.

　　近年研究证实，KC在正常皮肤中的细胞活性较低，分泌的细胞因子的种类和水平均较少.但病理条件下，KC合成和分泌的细胞因子已近30余种，并表达20多种免疫相关的细胞膜标记(包括几乎所有的细胞粘附分子、主要组织相容性复合体Ⅱ和其他膜抗原)，反映其参与并诱导细胞免疫、调节细胞增殖和蛋白合成，以及炎性趋化等作用的广泛性和复杂性[7] .我们另外的研究也证明，深度烧伤创面自愈后，组织中残留的皮肤附件上皮细胞及由其修复的表皮细胞表达几乎所有的细胞生长因子和粘附分子，并随瘢痕的增生组织中皮肤附件数量逐渐减少，至瘢痕萎缩期，皮肤附件几乎消失.结合本次研究结果，我们赞同Barker等[3] 提出的KC是皮肤免疫炎性反应的始动因素的观点，推测瘢痕增生及其增生过程中皮肤附件的减少，可能是自身诱导和放大局部免疫炎性反应的结果.创面愈合后，如何终止以KC为主修复细胞持续病理性高反应状态及其免疫诱导作用，可能是未来临床防治瘢痕增生和取得成效的重要途径.

　　参考文献:

　　[1]Barker JNWN，Mitra RS，Griffiths CEM，Dixit VM，Nickoloff nocytes as inatiators of inflammation [J].Lancet，1991;337(2):211-219.

　　[2]Brian JN，Christopher EM，Griffiths al cutaneus topobiology:The molecular basis for dermatopathologic mononuclear cell patterns in inflammatory skin disease [J].J Invest Dermatol，1990;95(6):1281-1290.

　　[3]Griffiths CEM，Voorhees JJ，Nickoloff terization of intercellular adhesion molecule-1and HLA-DR expression innormal and inflamed akin;modulation by recombinant gamma-interferon and tumor necrosis factor [J].J Am Acad Dermatol，1989;20(5):617-629.

　　[4]Bao WH，Wang CM，Zhu orphology research of keloid in different regions [J].Zhonghua Zhengxing Waike Za-zhi(Chin J Plastic Surg Burns)，1995;11(5):368-370.

　　[5]Placik OJ，Lewis logic associations of keloids [J].Surg Gynecol Obstet，1992;175(2):185-193.

　　[6]He CD，Wang YK，Chen sion of ICAM-1(CD54)and HLA-DR antigens on keratinocytes in some dermatoses [J].Zhonghua Pifuke Zazhi(Chin J Dermatol)，1996;29(3):183-185.

　　[7]Wang an Xibao Mianyixue Yanjiu Jinzhan(Immuno-logical advance keratinocytes)[A].In:Zhang XZ，Liu WD，Qin JZ dermatosis and sex transduced [M].Hefei:Anhui Kexue Jishu Chubanshe(Science and Technology Press of Anhui)，1997:1-10.

　　[8]Vejlsgaard GL，Ralfkiaer E，Avnstop C，Czajkowski M，Marlin SD，Rothlein cs and characterization of intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)expression on keratinocytes in various inflammatory skin lesions and malignant cutaneus lym-phomas [J].J Am Acad Dermatol，1989;20(5):782-790.

　　[9]Jiang DY，Chen B，Hu DH，Jia CY，Xu MD.A study on the mechanism of over scarring [J].Xi’an Yike Daxue Xuebao(J Xi’an Med Univ)，1998;19(4):557-562.

　　[10]Castagnoli C，Trombotto C，Ondei terization of T-cell subsets infiltrating post-burn hypertrophic scar tissues [J].Burn，1997;23(7-8):565-572.