光遗传学技术应用于动物行为学在神经回路中的研究进展

　　摘要：光遗传学(Optogenetics)在神经科学领域中得到迅猛发展，应用动物行为学分析是与光遗传学技术调控相匹配的解读体系之一。本文综述了光遗传学技术在动物焦虑相关行为学和社交行为学中的共同神经通路的研究应用，了解社交行为的神经回路如何调节复杂情感状态，精神性疾病的社交障碍的潜在机制，将发展并完善行为神经学。

　　关键词：光遗传学；神经回路；动物行为学；

　　作者简介：陈婷(1990-)，女，湖北人，硕士，研究方向：术后认知功能障碍的动物模型行为学研究。作者简介：张宗泽

　　光遗传学被《Naturemethods》评为2010年度生物技术［1］。光遗传学技术是将光学和遗传学技术相结合，利用病毒载体，将微生物视蛋白基因引入到载体动物的脑组织，采用不同波长和频率的光进行照射，通过刺激光敏感蛋白开启或关闭特定细胞类群或特定神经元的活动进而调控其功能，从而控制动物行为［2］。本文就光遗传学技术的基本方法及应用，以及其在神经-精神疾病动物模型中如何调控神经回路作一综述。

　　一、光遗传学技术

　　近来，研究者一直致力于不同行为的神经回路研究，探讨其投射连接，观察通过调控某一类神经元活动后的相应行为学表现。而电刺激和药理学的方法可能导致实验结果不准确，光遗传学技术具有目的性强、低损伤性、高时空分辨率和遗传特异性等特点，近年来在神经科学领域的生物学机制的研究中得到了广泛应用。光遗传学技术可包括下述几部分，对此作简单介绍。

　　1光敏感蛋白

　　生物体内存在着一类可以感受不同波长光的刺激，并对该光学刺激产生一系列效应的膜蛋白，即视蛋白。

　　目前，Ⅰ型视蛋白包括：细菌视紫红质(Bacteriorhodopsin，BR)，盐视紫红质(Halorhodopsin，HR)，通道视紫红质(Channelrhodopsin，ChR)。ChR在莱茵衣藻(Chlammydomonasreinhardti)中发现，为蓝光激活的阳离子通道蛋白，作用为阳离子内流，使细胞膜去极化。2005年，ChR2首次应用于光控制神经元活动的实验中。Ⅱ型视蛋白OptoXR，为视紫红质G蛋白偶联受体的嵌合体。是一种光敏感与G蛋白偶联的膜受体，G蛋白又称鸟苷酸结合蛋白，与G蛋白偶联的膜受体有很多种，如M胆碱能受体、多巴胺能受体等，可参与细胞内信号转导，还可调控如谷氨酸等神经递质的信号传递功能［3］。

　　2光敏感蛋白的表达

　　光敏感蛋白，是光遗传学的一种关键工具，在脑内诸多神经元中稳定表达。随着生物工程技术的发展，现在已经研发出许多将光敏感基因运载至细胞或神经元，并有效表达成光敏感蛋白的病毒载体。如腺相关病毒AVV、慢病毒、Cre-Loxp重组酶系统和各种转基因小鼠等。

　　3光刺激和信号记录

　　光刺激系统有光列二极管(LED)等。体外实验中，脑片电生理-全细胞膜片钳技术记录神经元放电信号，观察其光电流特征；在体实验中，在体立体定向注射病毒载体，经过10-14天待其充分表达后，构建光神经界面，植入光纤并固定，行在体光刺激，细胞膜内外离子差产生，膜电位发生变化，记录神经元的放电情况［4］。与光调控相匹配的解读体系包括电生理记录，功能磁共振成像或定量的动物行为学分析等。

　　二、光遗传学技术在神经科学研究中的应用

　　通过光遗传学技术可将光敏感通道蛋白表达在特定的细胞，用于突触可塑性、神经系统的疾病治疗、动物行为学、神经回路研究等多方面。

　　1突触可塑性的研究

　　树突棘是大脑神经元接受和传递信息的重要结构，是形成突触的关键部位，在突触可塑性中发挥重要作用。90%以上的兴奋性突触存在于树突棘头部中，应用光遗传学技术可以同时检测多个树突棘的信号，突破了停留在单个突触水平的研究。Takahashi等［5］通过对啮齿类动物海马区锥体细胞的上百个树突棘进行研究，发现临近的树突棘在自发活动中会趋于同步化，使得输入信号整合，成为动作电位输出。

　　也有研究应用光照激活星型胶质细胞上表达的ChR2能促发谷氨酸递质释放，可激活神经元的AMPA受体［6］，而AMPA受体与突触可塑性有关。这些研究表明通过选择性调节特异性神经元或神经细胞数量，光遗传学技术在突触可塑性研究中有较大应用前景。

　　2神经系统疾病的治疗研究

　　光遗传学技术除了检测大脑中癫痫发作的起始点外，还用于研究严重癫痫持续状态的持续或中止［7］。Sukhotinsky等［8］利用光遗传学技术揭示了海马兴奋型神经元在氯化锂-匹罗卡品诱导大鼠急性癫痫中的作用。

　　Alilain等［9］利用光遗传学技术将ChR2表达于膈肌运动细胞群，光照刺激下，颈部脊髓损伤的动物可以恢复呼吸运动。光遗传学技术也为帕金森症的神经机制提供了新的见解和思路。

　　3动物行为学和神经回路研究

　　动物交际行为学测试中，通过光遗传学技术可明确下丘脑泌素/进食素在特定情境中扮演的角色［10］。Huber等［11］利用光遗传学技术将ChR2表达在小鼠初级感觉皮层-桶状皮层神经元中，利用蓝光照射并结合奖励进行行为学训练的方式，蓝光照射时，小鼠向左转，给予水喝，作为正确识别的奖励，研究小鼠行为与光照之间的关系，证实小鼠奖赏记忆行为准确率与蓝光照射有较强的相关性。

　　神经回路是神经细胞、分子活动和脑整体活动的连接桥梁。运用光遗传学技术，在动物中实现了对神经元和突触的高时间分辨率、高精确度的光学调控，为动物行为学的神经回路的研究提供较好的一个方法学技术。

　　三、光遗传学技术在动物行为学中的应用研究

　　光遗传学技术在动物行为学应用中有良好前景，尤其适用于探索特定类型神经元活动范式与动物行为改变之间因果关系的研究。光遗传学技术在动物交际行为、恐惧记忆行为、奖赏记忆行为、焦虑样行为等行为学的神经回路进行深入研究，不仅可以记录活体动物的脑整体活动，也可记录拟研究神经回路活动的细胞、分子的活动表现，是研究动物行为学的神经回路的一个重要事件，推动了神经回路研究的进步。

　　然而，涉及神经回路和脑功能的研究，不能直接在人体上进行，动物模型成了重要选择。能否在动物身上建立精神性疾病模型存在争议。例如，精神性疾病的一些诊断特点，如悲伤，内疚，妄想和思维混乱，这些症状在动物模型中难以确定［12］。目前，已成功建立了能概括精神性疾病重要特征，如恐惧记忆、焦虑症、抑郁症等动物模型。同时，应用光遗传学阐明啮齿动物模型中有关精神疾病许多复杂行为的相关神经通路。

　　1焦虑-社交障碍症候群动物行为学

　　根据临床资料，焦虑症和社交功能障碍之间有着显著的联系，这种联系可能为理解焦虑症和社交障碍的共同神经通路提供线索。抗焦虑药物可减少当动物被放置在易焦虑环境中的社交受损［13］。不同的自闭症小鼠模型均表现出明显的社交功能障碍以及增强的焦虑样行为［14］。这些研究均表明，焦虑症和社交功能是紧密联系的，并且可能存在一个共同的病理神经机制。

　　2焦虑样行为的动物行为学

　　焦虑鼠模型的光遗传学研究，发现特定的杏仁核突触，可快速可逆地调制焦虑水平。Tye等［15］研究发现，利用ChR2成功表达后，进行光照射，可以通过激活基底外侧杏仁核(BasolateralAmygdala，BLA)到中央杏仁核(CentralAmygdala，CeA)的突触投射，小鼠的开臂时间增多，表明产生去焦虑样行为；利用eNpHR3.0成功表达后，进行光照射，可以通过抑制突触连接，小鼠在高架十字迷宫的开臂时间减少，小鼠表现为焦虑样行为。

　　为了研究基底外侧杏仁核-腹侧海马(vHPC)通路，研究者［16］将感光视蛋白表达于BLA谷氨酸能神经元且视觉纤维被定位在BLA轴突终止的vHPC内，光刺激BLA中止于vHPC的胆碱能神经元诱发的焦虑样效应被vHPC的谷氨酸能神经元抑制，证实兴奋BLA-vHPC神经通路可增加焦虑，抑制BLA-vHPC的轴突将减少焦虑鼠模型中焦虑相关行为。此研究确定了BLA-vHPC为一个双向控制焦虑相关行为的神经通路。

　　3基底外侧杏仁核-腹侧海马(BLA-vHPC)神经回路的阐明

　　疾病动物模型如恐惧记忆的神经回路研究，得益于鼠听觉恐惧反射的杏仁核模型，即杏仁核恐惧条件反射。Petreanu等［17］利用光遗传学技术将ChR2表达在大鼠丘脑核和运动皮层兴奋性神经元上，通过光刺激，在活体脑进行电位记录，实现了兴奋性神经元与体感觉皮层锥体细胞间突触的精确定位。这一方法，为研究完整神经回路中发生突触联系的神经元提供了较为广阔的途径。

　　源于恐惧动物模型的焦虑症研究中，人类的焦虑和动物条件恐惧间存在相似的神经回路。海马是应激反应的作用靶区，其发出的神经纤维可投射到杏仁核相关情感脑区，参与情绪反应和学习记忆等，其损伤可致负性情绪的发生［18］。在人类研究中，已被证实海马和杏仁核在编码情感记忆时彼此依赖。此外，临床观察患者海马体积与焦虑的严重程度成正相关，多个功能核磁共振(Funcitonalmagneticresonanceimaging，fMRI)研究发现恐惧形成与杏仁核有关［19］。在焦虑症和社交行为的研究中，杏仁核的投射可能涉及到的上、下游区域的神经通路。vHPC为一相关联区域，它与杏仁核紧密连接。在非人类灵长类动物中，海马病变将导致对社会信号和社会关系退化的异常反应。啮齿动物研究证实vHPC对恐惧和焦虑相关行为的表现行为非常重要，并参与社交行为的调节［12］。

　　焦虑症与社交障碍相关联，杏仁核和海马均参与此过程。通过三腔社会互动行为学实验和社会交互行为学实验对啮齿动物社交能力进行测试［20］，结果表明，抑制BLA-vHPC通路提高了社交能力，激活该通路降低了社交能力。