微生物快速法测定BOD项目的研究与探讨

随着环境保护事业的蓬勃发展，各级环境监测部门加强了对水体中有机污染状况的监测，其中BOD项目的监测作用是其他项目无法替代的。在各项科学严谨的质量管理体系下，在实验室质控手段完备的条件下，本文以HJ/T86-2002《微生物传感器快速测定法》作为检测标准，对各行业实际样品进行监测分析，指出了该方法的影响因素、注意事项及应用范围，并阐述该方法存在的问题和解决方法。
　　一、仪器与试剂
　　（一）仪器
　　本文所使用的仪器是220B型BOD快速测定仪（天津赛普环保科技发展有限公司）。
　　（二）试剂
　　1. 磷酸盐缓冲溶液（0.5mol/L）：68g磷酸二氢钾和71g磷酸氢二钠用蒸馏水溶解后移入1000ml容量瓶中，用水稀释至标线。
　　2. 磷酸盐缓冲溶液使用液（0.005mol）：用上述溶液稀释100倍。
　　3. 葡萄糖-谷氨酸（BOD）标准溶液（2500±37mg/L）：称取在103℃下干燥1小时并冷却至室温的无水葡萄糖和谷氨酸各1.705g，融于磷酸盐缓冲溶液使用液，并用此溶液稀释至1000ml，混合均匀。
　　二、实验部分
　　（一）数据
　　经过实验室大量实验数据的比对，与稀释接种法的比较数据如下表1所示。
　　在大量样品分析的基础上（见表1），与标准稀释法相比，微生物传感器快速测定BOD法具有以下特点。一是操作易行、监测时间短。微生物传感器快速测定BOD的测量时间是8min，清洗时间是25min，能迅速反映水质情况，以实现快速监测。二是标准稀释法所需时间长，并且实验步骤中难免出现人为或客观条件出现误差，影响数据准确度。而微生物法中机器对温度控制的精度好（温度设置为33℃），实验过程全部在恒温条件下监测，避免了硝化作用产生的影响。三是对可生化性好的水样测定稳定，重现性好。与标准稀释法5d的培养过程相比，微生物快速法测定可生化性好的水样时，BOD数值比较稳定，精度高，避免了标准稀释法的一系列监测数据偏差。
　　同时，微生物快速法测定BOD也存在以下几个问题。一是当监测的实际样品中含有毒有害物质（如农药类、高浓度杀虫剂、游离氯废水等）时，会减少甚至杀死微生物菌种。因此，此类水样不适用此方法测定。二是当样品中悬浮物达到一定浓度时，会干扰样品的测定，影响数值的准确度。此时，应在样品静置30分钟后，再取中间液进行分析。三是此方法测定BOD项目，主要依靠生物膜内的微生物菌种活性，菌种的活性在实验过程中起关键作用。在关注菌种生存周期的基础上，根据实际样品的实际情况合理使用标准物质进行标准定点工作。
　　（二）微生物膜的活化及更换
　　将菌膜放入0.005mol/L缓冲溶液中活化一周左右，其活化过程应在温度保持21℃左右的恒温恒湿箱内进行，然后将其安装在微生物传感器上。菌膜上的菌种作为活性物质是有寿命的，除温度、湿度影响其寿命以外，主要受使用频率、水样污染程度、使用期间的维护和保养等的影响。当遇到以下情形时须更换生物膜：一是连续正常工作30天以上；二是验证标准溶液的监测数据的灵敏度下降；三是正常的菌种被伤害或是被杀死；四是菌膜正常工作后连续停机7天以上。当机器使用频率低时，必须保证每周用缓冲溶液清洗机器1～2次。在保证初始电位在4～10之间时可持续使用菌膜。灵敏度是衡量生物膜工作是否正常的标准，若灵敏度数值在下降，则需及时更换生物膜。
　　（三）标准系列的确定
　　微生物的菌种与待测水样（非有毒有害的）存在“共生”关系。样品的BOD浓度影响微生物的活性，样品通过微生物监测获得BOD浓度值。为保证监测结果的准确性，一般用两点定标进行分析。根据不同行业和来源的水样，总结归纳并选择相应适合的控制浓度电位进行定标工作，并且每个工作日至少定标一次。根据样品的实际情况，有条件的可以选择每批次样品定标一次或多次，以确保数据准确。在机器正常运行且菌膜活性良好的条件下，经大量实验得到一组样品浓度与之相对应电位值数据（见表2）。数据仅供参考。若样品浓度相对应的电位值降低10%，可作为更新菌膜的依据。
　　（四）管路的更换
　　当蠕动泵进样速度不为匀速时，可能是管路老化造成的，此时应考虑更换管路。当监测工作密度加强，管路中必然存留微生物，从而导致管路液体流速下降。根据仪器要求需定期更换管路。管路更换时间与机器的使用频率、水样的来源及污染程度，以及管路的材质等均有关系。因此，在日常维护中，在保证数据的准确的前提下，可依据仪器使用频率和水样的污染程度等更换管路。当标准样品分析数据的精密度下降时即可更换管路。
　　（五）干扰物质的控制
　　表3介绍了几种干扰物的最大限量，通过对大量样品反复实验，在保证测量结果准确性的前提下，列出较适宜的低于最大限值的标准规定值。含0.5mg/L以下的游离氯一般对数据的结果不会产生明显的干扰，而且还能对管路、流通池、菌膜有一定的清洗作用。含高浓度的游离氯的样品可加入1.575mg/L的亚硫酸钠溶液（不宜过量，否则产生负干扰），使游离氯或结合氯去除。被测样品中的悬浮物对BOD测定的干扰是令人关注的问题，为此进行如下实验。由于六次甲基四胺在测定中会产生干扰，因此选用硅藻土作为悬浮物标准物质并配成悬浮物50mg/L、102mg/L、280 mg/L的溶液进行实验（见表4、表5、表6）
　　从表4、表5、表6中可以看出，含有5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L的BOD溶液的样品中悬浮物含量从50～280 mg/L对BOD的测定结果的相对误差分别在-2.0～6.0、-2.4～6.0%、-2.0～3.2%之间，因此在标准中确定为含有悬浮物浓度低于250mg/L的样品， BOD项目的测定结果影响很小。
　（六）缓冲溶液的选择
　　测定样品的pH值应控制在7左右。因此，选择混合磷酸盐作为缓冲溶液，一方面可以在一定程度上缓冲调节样品的pH值，使其符合测定的要求，另一方面也可对含有高浓度的重金属离子的样品起到沉降的作用。大量实验数据显示：样品的pH值在4～10之间时，不需要对水样进行酸碱处理即可符合正常的监测条件。
　　（七）管路气、液比的调整
　　仪器进样管路中的气液比是厂家在大量反复实验后得出的经验理论值，可在仪器使用前设定好，也可在实际运行操作中进行调整，但总原则是保证流通池中有充分的氧。为保证数据的准确性，在保证样品代表性的前提下，在测定过程中进样 总量必须大于10ml。
　　（八）样品测定时间
　　根据仪器的操作规程，测定样品的时间设定是8min，清洗时间为25 min。样品测定时间与样品浓度是成比例的，为保证测定周期内数据的准确性，一般要求样品浓度低于50mg/L（25mg/L左右最佳）。若样品浓度低，分析时间会相应缩短，与工作曲线的线性范围0～50 mg/L是相吻合的。
　　（九）样品的贮存
　　国内各标准文献对BOD项目水样的保存提出了“即测定值将随水样贮存时间而降低……”，分别探讨了4℃、-22℃、酸化至pH为1.5和酸化并在-22℃四种条件下保存，以上方法尽非人意。因此，总原则是贮存时间应尽量缩短。我国《地表水和污水监测技术规范》中规定BOD样品的保持条件为0℃～5℃避光，一般采样后6小时之内进行检验，若需远距离运转，在任何情况下贮存不能超过24小时。国外有关的标准文献规定了对采集的样品2小时之内进行分析的，无需冷藏。采集样品2小时后分析的样品需保存在4℃以下，冷却降温至接近冰点以减少误差。当不能在6小时内分析时，实验记录应标注保存时间与温度。对于贮存时间大于24小时的样品不能分析。配制标准样品的分析结果一定要在6小时内完成。
　　表7中1～6样品均为处理后的废水样品，7～8样品为标准样品。经实验表明，在对处理后的废水中BOD浓度放置8小时后，其浓度降低了20%左右。样品的贮存在分析中易被忽视且样品保存客观上也存在的问题，应用快速监测法来解决样品保存难题。
　　三、分析过程中应注意的几个问题
　　（一）每日必做的检查
　　每日在开机后，实验开始之前，应先检查初始电位是否在正常范围内，检查清洗液是否流动顺畅，再检查流量和气量是否在正常范围内，然后在进行分析实验。
　　（二）菌膜的培养和调试
　　在菌膜培养过程中，至少应培养7天以上，一般在15天，温度控制在21℃左右。及时更换营养液（浓度为0.005 mol /L磷酸盐缓冲溶液使用液），每天营养液约需500ml。当培养完毕装入电极内后，需加入同一系列标样（数量控制在20个左右）来激活菌膜的活性。标样一般所需的浓度在20～30mg/L，调试周期在3天左右。当△I值在5～9之间时，首先比较电位与浓度的比例是否合理，其次比较加入的系列标准的相对偏差（<1%）是否在合理范围内，若比例合理便可正常进行水质分析。新换的菌膜，达到稳定状态后，应多给一些浓度在15～20 mg/L的标液走样，期间可少量穿插30～40mg/L的标样以刺激并保证菌膜的活性。
　　（三）当起始电位在正常范围内出现异常波动
　　分析过程中，在正常范围起始电位出现异常波动（即波动超过0.05的范围）时，首先检查透氧膜是否破损。若无异常，再检查生物膜是否异位或破损。若再无异常，再做空载实验检查电极是否出现问题。
　　（四）测定仪换膜后的起始电位（>10）不正常
　　首先检查菌膜是否松动，菌膜应紧贴电极透氧膜，勿破损或折皱透氧膜。其次，增加清洗时间，甚至是清洗一天，随着时间电位会逐步降低，如若电位仍不在正常范围内，则应重新正确安装透氧膜，至起始电位恢复到正常范围内为准。
　　（五）缓冲溶液不能正常流动，机器不能正常进行清洗工作
　　首先，检查机器的流量和气量是否正常，若有异常调整其运行状态至正常。其次，检查缓冲泵是否能正常运转。最后，检查清洗的管路是否畅通，若管路使用时间过长或样品等原因造成管路堵塞问题，应及时更换新的管路。
　　（六）样品测试过程中进样时的注意事项
　　进样时应避免输液管路进入气泡，测量过程中的进样浓度应从低到高，以减少回复到空白电位所需的时间。勿使其他溶液漏入电极内参比溶液中，以免造成污染。
　　另外，关机后再开机至少间隔15秒，否则仪器不能正常工作。
　　此上是在执行和贯彻标准方法过程中的一些实验结论和使用方法，是日常容易出现并应注意的问题。
　　（作者单位：天津市滨海新区大港环境保护监测站）